Die Insertion des „minor coat“ Proteins G3P des Bakteriophagen M13 in die innere E. coli Membran benötigt die Insertase YidC und die Translokase SecYEG.

Kleinbeck, Farina

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Kleinbeck, Farina

Die Insertion des „minor coat“ Proteins G3P des Bakteriophagen M13 in die innere E. coli Membran benötigt die Insertase YidC und die Translokase SecYEG.

The insertion of the minor coat protein G3P of the bacteriophage M13 into the inner E. coli membrane is dependent on the insertase YidC and the translocase SecYEG.

Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:100-opus-19481
URL: http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2021/1948/

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SWD-Schlagwörter:

Escherichia coli , Bakteriophagen , Proteintransport

Freie Schlagwörter (Deutsch):

Bakteriophage M13 , G3P , Membraninsertion , Sec Translokase , YidC Insertase

Freie Schlagwörter (Englisch):

bacteriophage M13 , G3P , membrane insertion , Sec translocase , YidC insertase

Institut:

Institut für Mikrobiologie

Fakultät:

Fakultät Naturwissenschaften

DDC-Sachgruppe:

Biowissenschaften, Biologie

Dokumentart:

Dissertation

Hauptberichter:

Kuhn, Andreas Prof. Dr.

Sprache:

Deutsch

Tag der mündlichen Prüfung:

06.09.2021

Erstellungsjahr:

2021

Publikationsdatum:

12.10.2021

Lizenz:

Veröffentlichungsvertrag mit der Universitätsbibliothek Hohenheim ohne Print-on-Demand

Kurzfassung auf Deutsch:

Die Membran einer jeden Zelle bildet eine Begrenzung für diese kleinste Einheit einer Lebensform. Eine solche sehr einfache einzellige Lebensform stellt dabei auch ein gramnegatives Bakterium dar und deswegen ist auch Escherichia coli (E. coli) ein Modellorganismus für eine lebende Zelle. Durch deren innere Membran, werden dessen Zellbestandteile in unmittelbarer Nähe zusammengehalten und vom extrazellulären Milieu abgegrenzt. Die meisten Stoffe können diesen Lipidbilayer, der die Membran bildet, nicht einfach passieren, weshalb ein Import- und Exportsystem geschaffen werden musste, das dieses bewerkstelligt. Für dieses Import- und Exportsystem werden sehr komplexe teilweise mehrspännige Transmembranproteine benötigt. Beispiele dafür sind Ionenkanäle und Ionenpumpen, oder große Kanalkomplexe, über die die Energiegewinnung, die Sekretion von Toxinen und Botenstoffe stattfindet. Aber auch Proteine mit Funktionen im Periplasma oder der äußeren Membran müssen von ihrem Syntheseort Zytoplasma an ihren Zielort gelangen. Für diese vielseitigen Prozesse müssen Proteine in die innere Membran inseriert oder über diese transloziert werden. Vom Gesamtproteom in Prokaryoten werden etwa 25 bis 30 % entweder in die innere Membran inseriert oder sekretiert. In dieser Arbeit konnten einige Komponenten identifiziert werden, die für die Insertion des „minor coat“ Proteins G3P des M13 Bakteriophagen notwendig sind. Dieses Protein liegt für die Assemblierung des Phagenpartikels mit dem äußersten C-Terminus über ein einzelnes Transmembransegment in der inneren Membran verankert vor, während der Hauptteil des etwa 42 kDa großen Proteins im Periplasma ist. Mit Hilfe eines N-terminalen abspaltbaren Signalpeptids wird der Hauptanteil von G3P mit Hilfe von SecA und dem Membranpotential über SecYEG in das Periplasma transloziert. Das Targeting hingegen konnte nicht eindeutig einem der bekannten post- oder kotranslationalen Signalwegen zugeordnet werden. Zwar konnte in vivo über arretierte RNCs ein Kontakt mittels Disulfid Crosslinkstudien zu Ffh, der Proteinkomponente des Ribonukleoproteins SRP gezeigt werden, allerdings war die Insertion in die Membran in vivo unabhängig von Ffh und auch bei gestörter Interaktion zwischen SecY und FtsY, dem Rezeptor für SRP an der Membran, konnte G3P mittels SecYEG inseriert werden. Das Chaperon SecB konnte zwar in vitro an G3P binden, in vivo inserierte G3P ebenfalls SecB unabhängig. Möglich wäre für G3P auch ein SecA abhängiges Targeting. Für den Membraneinbau von G3P konnte gezeigt werden, dass in vivo neben SecYEG auch YidC benötigt wird. Mit Hilfe von Disulfid Crosslinkstudien konnte gezeigt werden, dass G3P zunächst über das Signalpeptid von G3P mit der Plug-Domäne TM2b und dem lateralen Tor (TM2a und TM7) in Kontakt tritt und schließlich das C-terminale Transmembransegment von G3P mit YidC über die TM3 und TM5 der hydrophilen Rutsche in die Membran gelangt. Anhand dieser Kontaktpunkte wurde ein mögliches Insertionsmodel bestätigt, wobei SecY und YidC definierte Schritte im Insertionsprozess vermitteln und somit neue Einblicke in diesen weitestgehend unbekannten Prozess liefern.

Kurzfassung auf Englisch:

The membrane of every cell forms a spacial limitation for this smallest unit of a life form. Such a very simple unicellular life form is also the Gram-negative bacterium Escherichia coli (E. coli) and is therefore a valid model organism for a living cell. Due to the inner membrane the cellular components are held together in close proximity and are separated from the extracellular environment. Most substrates cannot pass the lipid bilayer, which forms the membrane, so an import and export system had to be developed to accomplish this. For these import and export systems, very complex, polytopic transmembrane protein complexes are needed. Examples are ion channels, ion pumps or large complexes through which energy production, secretion of toxins and the transfer of nutrients are catalysed. Moreover, proteins with functions in the periplasm or outer membrane must also travel from their site of synthesis in the cytoplasm to their destination. For these different processes proteins must be inserted into or translocated across the inner membrane. Of the total proteome in prokaryotes approximately 25 to 30% is either inserted into or secreted across the inner membrane. This work identified several components required for the insertion of the "minor coat" protein G3P of M13 bacteriophage. This protein is important for the assembly of the phage particle that occurs in the inner membrane. The outermost C-terminus of G3P is anchored in the inner membrane via a single transmembrane domain, while the bulk of the approximately 42 kDa protein is located in the periplasm. Using an N-terminal cleavable signal peptide, the major portion of G3P is translocated into the periplasm via SecYEG with the help of SecA and the membrane potential. Targeting, on the other hand, could not be clearly assigned to one of the known post- or co-translational pathways. Although contact via disulfide crosslink studies to Ffh, the protein component of the ribonucleoprotein SRP, was observed via stalled ribosome nascent chains (RNCs), insertion into the membrane in vivo was independent of Ffh. Even when the interaction between SecY and FtsY, the receptor for SRP at the membrane, was impaired, G3P was inserted via SecYEG. Although the chaperone SecB was able to bind to G3P in vitro, G3P inserted independently of SecB in vivo. For membrane incorporation of G3P, it was shown that YidC is required in vivo in addition to SecYEG. Disulphide crosslink studies demonstrated that G3P first contacts the plug domain TM2b and lateral gate (TM2a and TM7) via the signal peptide of G3P, and finally the C-terminal transmembrane domain of G3P contacts YidC via TM3 and TM5 of the hydrophilic slide. Based on these contact sites, a possible insertion model was confirmed, with SecY and YidC mediating defined steps in the insertion process, providing new insights into this largely unknown process.