Universität Hohenheim
 

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Gilbert, Max

Prediction of protein-protein complexes by combining size exclusion chromatography and mass spectrometric analysis

Vorhersage von Protein-Protein-Komplexen durch Kombination von Größenausschlusschromatographie und massenspektrometrischer Analyse

(Übersetzungstitel)

Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:100-opus-19403
URL: http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2021/1940/


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SWD-Schlagwörter: Proteomanalyse , Interaktion , Proteine , Schmalwand <Arabidopsis> , Netzwerk
Freie Schlagwörter (Englisch): Proteomics , Interaction , Arabidopsis , Network
Institut: Institut für Physiologie und Biotechnologie der Pflanzen
Fakultät: Fakultät Naturwissenschaften
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Schulze, Waltraud Prof.
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 26.08.2021
Erstellungsjahr: 2021
Publikationsdatum: 29.09.2021
 
Lizenz: Creative Commons-Lizenzvertrag Dieser Inhalt ist unter einer Creative Commons-Lizenz lizenziert.
 
Kurzfassung auf Englisch: Two major objectives were pursued and met in this study.
First, the goal was to add to the scientific toolbox a diligent method for uncovering PPi dynamics on a proteomic scale, with a focus on plant membranes. There are large-scale or high-throughput approaches, but they rely on genetically modified proteins or heterologous expression systems to describe PPi outside of their natural context. Similarly, those methods are incapable of describing the dynamics of protein interactions. In course of this study, a co-elution based approach was combined with modern mass spectrometric label free quantification in order to investigate PPi and interaction dynamics on a proteomic scale. A rigorous data processing pipeline was developed to not only address known fallacies of using co-elution based methods (such as for example random co elution), but also to access and utilize meta-information in form of protein abundance and protein network connectivity to draw conclusions not only on proteomic scale, but also for individual proteins. In total, 6.928 individual proteins extracted from Arabidopsis thaliana root membranes were detected under different nutritional conditions (full nutrition, nitrogen starvation and nitrogen resupply). The data processing pipeline described in this study was used to predict and discover connectivity information for at least 2.058 of these proteins. Each step in data processing was validated by comparison to database confirmed interactions to improve filtering criteria. Protein abundance was evaluated through a unique ranking system, allowing a seamless integration as network attributes for each condition. From the suggested interaction data, an interactome network of the various nutritional conditions was reconstructed. Using different network parameters from graph theory, protein significance and dynamic conditional changes were described.
Second, this study applied the aforementioned approach to identify relevant proteins involved in nitrogen signaling in Arabidopsis thaliana root membranes. Through correlation analysis and network reconstruction, receptor kinase AT5G49770 was identified as a component of the nitrogen signaling network that collaborates with co-receptor QSK1, BAK1, the nitrogen transporter NRT2.1 and proton pump AHA2. In response to nitrogen deficiency, the network parameters of AT5G49770 reacted strongly and its involvement was demonstrated by a phenotypic similarity to knock-out lines of NRT2.1, NRT1.1 and AHA2 during a root growth assay of Arabidopsis seedlings. The interaction between QSK1 and BAK1 was further confirmed using FRET/FLIM microscopy and pulldown assays.
These findings show that combining a co-elution based approach with a rigorous data processing pipeline and network analysis is suitable to study the protein interaction environment and signal response dynamics in plant root membranes. The modular experimental design allows for a simple adaptation to study different stimuli and the unbiased proteomic approach yields results for proteins regardless of the individual scientific focus. Meta-information such as protein abundance and network connectivity parameters can be used to prospect and identify important proteins involved in stress response dynamics.
The author of this study is confident that the proteomic data produced can be utilized in further research and contributes to the understanding of nitrogen signaling in plant root membranes. Through integration of the data processing pipeline and adaptation to different scientific scenarios, valuable information beyond protein interaction is gained. Thus, this work makes an important contribution to the advancement of proteomic analysis and data interpretation methodology.
 
Kurzfassung auf Deutsch: In dieser Studie wurden zwei Hauptziele verfolgt und erreicht.
Zunächst war es dezidiertes Ziel dieser Arbeit das wissenschaftliche Methodenspektrum um eine sorgfältige Methode zur Aufdeckung von Protein-Protein Interaktionsdynamiken auf proteomischer Ebene unter besonderer Berücksichtigung der pflanzlichen Membranumgebung zu ergänzen. Zwar gibt es Ansätze für large-scale oder high-throuput Methoden, jedoch sind diese auf genetisch veränderte Proteine oder heterologe Expressionssysteme angewiesen und beschreiben PPi damit außerhalb des natürlichen Kontextes. Ebenso sind diese Methoden ungeeignet, um Dynamiken von Proteininteraktionen zu beschreiben. Zu diesen Zweck wurde in dieser Studie eine Methode entwickelt, die Vorteile eines Co-Elutions-basierten Ansatzes mit modernen label-freien massenspektrometrischen Quantifizierungsmethoden kombiniert. Dazu musste eine belastbare Datenverarbeitungspipeline entwickelt werden, um nicht nur bekannte Fallstricke von Co-Elutionsmethoden (wie z.B. zufällige Co-Elution) zu vermeiden, sondern auch um Metainformationen wie Proteinhäufigkeit oder Netzwerkkonnektivität zu erschließen und nutzbar zu machen. So können Schlussfolgerungen nicht nur auf proteomischer Ebene, sondern auch für individuelle Proteine gezogen werden. Im Rahmen dieser Studie wurden Arabidopsis thaliana Wurzelmembranproteine untersucht. Insgesamt konnten 6.928 individuelle Proteine extrahiert, identifiziert und unter verschiedenen Nährstoffverfügbarkeiten (Normalbedingung, Stickstoffmangel und Stickstoffzufuhr nach Mangel) untersucht werden. Die in dieser Studie beschriebene Datenverarbeitungspipeline wurde verwendet, um PPi für mindestens 2058 dieser Proteine vorherzusagen und zu beschreiben. Jeder Schritt der Datenverarbeitung wurde durch den Vergleich mit datenbankbestätigten Interaktionen kontrolliert, um die Filterkriterien zu verbessern. Aus den vorhergesagten Interaktionen wurde ein Interaktom-Netzwerk der verschiedenen Ernährungszustände rekonstruiert, anhand dessen die Bedeutung der Proteine für den entsprechenden Ernährungszustand durch verschiedene Netzwerkparameter aus der Graphentheorie beschrieben werden konnte. Die Proteinabundanzen wurde durch ein einzigartiges Ranking-System bewertet, was eine nahtlose Integration als Netzwerkattribute für jede Bedingung ermöglichte.
Weiterhin zielte diese Studie darauf ab, das Verständnis des Stickstoff-Signalwegs anhand von Arabidopsis thaliana Wurzelmembranen als Modell zu vertiefen. Unter Verwendung des zuvor etablierten Co-Elutions-Workflows, der Korrelationsanalyse und Netzwerkrekonstruktion wurde die Rezeptorkinase AT5G49770 als wichtiger Einflussfaktor bei der Stickstoff-Signalübertragung in Verbindung mit dem Co-Rezeptor QSK1, dem Stickstofftransporter NRT2.1 und der Protonenpumpe AHA2 identifiziert. Die Netzwerkparameter von ATG549770 zeigten die größten Veränderungen als Reaktion auf Stickstoffmangel. Die Beteiligung wurde durch eine phänotypische Ähnlichkeit zu Knock-out-Linien von NRT2.1, NRT1.1, QSK1 und AHA2 in einer phänotypischen Charakterisierung des Wurzelwachstumstests von Arabidopsis Keimlingen gezeigt. Die Interaktion zwischen QSK1 und AT5G49770 wurde weiterhin durch FRET/FLIM-Mikroskopie und Pulldown-Analyse bestätigt.
Die Ergebnisse zeigen, dass die Kombination eines auf Co-Elution basierenden Ansatzes mit einer rigorosen Datenverarbeitsungs-Pipeline und der Netzwerkanalyse geeignet ist, um Proteininteraktionsnetzwerke und Signalantwortdynamik in Pflanzenwurzelmembranen zu untersuchen. Das modulär konzeptionierte Versuchsdesign ermöglicht eine einfache Anpassung der Methodik zur Untersuchung verschiedener Stimuli, während die unvoreingenommene proteomische Analytik Ergebnisse unabhängig des individuellen wissenschaftlichen Fokus erzielt. Metainformationen wie Proteinabundanz und Netzwerkkonnektivitätsparameter sind geeignet, um Proteine, die maßgeblich an der Dynamik von Stressreaktionen beteiligt sind zu identifizieren.
Der Autor dieser Studie ist zuversichtlich, dass die erzeugten proteomischen Datensätze für weitere Forschung genutzt werden können und zu einem tieferen Verständnis der Stickstoffsignal-Regulierung in pflanzlichen Wurzelmembranen beitragen. Zusätzlich demonstriert diese Studie, dass über die Erschließung von Metadaten wichtige Informationen gewonnen werden können, um in verschiedenen wissenschaftlichen Szenarien einen Erkenntnisgewinn zu ermöglichen. Damit leistet diese Arbeit einen wichtigen Beitrag zur Weiterentwicklung der proteomischen Analytik und Datenauswertung.

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