Universität Hohenheim
 

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Borda Molina, Daniel Enrique

High-throughput sequencing techniques to analyze microbial communities in the gastrointestinal tract of broiler chickens

Hochdurchsatz-Sequenzierungstechniken zur Analyse mikrobieller Gemeinschaften im Darmtrakt von Broilern

(Übersetzungstitel)

Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:100-opus-15965
URL: http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2019/1596/


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SWD-Schlagwörter: Mikroflora , Darmflora , Phytase , Proteasen , Broiler
Freie Schlagwörter (Deutsch): Darmmikrobiom
Freie Schlagwörter (Englisch): Gastrointestinal microbiome , 16S rRNA sequencing , phytase , protease , broiler chickens
Institut: Institut für Nutztierwissenschaften
Fakultät: Fakultät Agrarwissenschaften
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft, Veterinärmedizin
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Camarinha Silva, Amélia Jun.-Prof. Dr. rer .nat.
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 10.12.2018
Erstellungsjahr: 2018
Publikationsdatum: 09.04.2019
 
Lizenz: Hohenheimer Lizenzvertrag Veröffentlichungsvertrag mit der Universitätsbibliothek Hohenheim
 
Kurzfassung auf Englisch: Broiler chicken represents an excellent case-study to elucidate the inter-communication between the host and its microbial communities. The general aim of this thesis was to describe the changes in bacterial community structure that occurred in chickens, in response to different experimental diets. An update of the state of the art of the chicken gastrointestinal microbiota was done in chapter 2. The composition and functionality are described through the most recent technologies that provide taxonomic information at DNA level using 16S rRNA genes. Gene catalogs and their abundance are deciphered through shotgun metagenome sequencing, which is still at its infancy and only eight publications have been published so far. At the protein level, only two studies were found that contribute metaproteomic information. Thanks to these technologies many studies were able to focus on answering how feed supplementations altered the microbes in GIT sections.
The second part presented in chapter 3 comprises an extensive investigation of the broiler chicken microbiota composition in digesta and mucosa of individual samples under varying supplementation of calcium, phosphorus, and phytase. The dietary impact on the distribution of the microbial communities was studied in the crop, ileum, and caecum through illumina sequencing of the 16S rRNA gene. One important outcome was the high variability in the microbial composition between individual samples. Significant differences were observed between the digesta and mucosa samples, supporting the hypothesis that being close to the host, mucosa-associated communities show a different composition. A calcium effect on the performance was observed, where values for body weight gain and feed conversion were lower in comparison to the other treatments. Microbial communities in the crop mucosa revealed a dietary effect, while in the digesta samples no significant changes were seen. Regarding the ileum mucosa, there was an effect of P addition on the microbial distribution. As expected, caeca-derived samples showed an increase in the diversity indexes when compared to the ileum and crop and butyrate producers were detected in higher abundance. A lower microbial diversity in the crop was linked to lower growth performance regarding the supplementation of Ca. Hence, each dietary treatment affected the microbial communities; nevertheless, none of the dietary treatments displayed a consistent effect across the studied gut sections.
Additionally, the effects of supplementing different proteases and one phytase on the microbial community of the ileum of broiler chickens was assessed. Thus, the specific aim of chapter 4 was to determine how enzyme supplementation affects the microbiota composition in the ileum of broilers and whether these effects were related to differences in pre-caecal AA digestibility. Three different protease sources at a low and high level were included. The microbial taxonomy was assessed through 16S rRNA gene Illumina amplicon sequencing. Performance results revealed a significant increase in growth and feed efficiency in broilers fed with phytase only and the high dosage of protease C, in comparison to the control. Most of the AA showed a significant difference between the control diet and protease C at high dosage and phytase diets. Effects on microbiota composition were observed at the genus level for some protease and phytase supplementations. The genera Streptococcus, Lactobacillus, and uncultured Clostridiaceae were responsible for these differences. This study demonstrates that effects of enzyme supplementation were evident in the terminal small intestine microbiota composition, and, to a lesser extent, in pc AA digestibility. However, the changes in microbiota composition and pc AA digestibility could not be correlated which may indicate the absence of a causal relationship.
Finally, an outlook with metagenome sequencing is presented in chapter 5, to further characterize the result of feeding strategies. Metabolism information, essential to microbial activities registered 50% of abundant genes in the supplemented diets while being reduced to 40% in the control samples Phosphatases pathways and butyrate production increased in the supplemented diets while calcium signaling pathway was higher in the control.
In conclusion, within this project a method of standardization to study the microbiota along the gastrointestinal tract of broiler chickens was successfully established. The obtained results revealed a significant impact of both, enzyme and mineral supplementation in the individual sections of the GIT. Also, it was proved that even if the GIT works as an interconnected system, its compartmentalization creates different environmental conditions which influence the microbiota. This study provides insights into the responses of the bacteria and their functionality which were stimulated by the feed supplementations.
 
Kurzfassung auf Deutsch: Broiler, die als Modellorganismus für Nicht-Säugetierarten etabliert sind und deren Genom seit 2004 sequenziert und verfügbar ist, stellen eine ausgezeichnete Fallstudie dar, um die Kommunikation zwischen dem Wirt und seinen intestinalen Mikrobengemeinschaften aufzuklären. Das Verständnis der mikrobiellen Ökologie und die Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen den Mikroorganismen und ihrem Wirt, bieten eine Möglichkeit um nach Alternativen zu suchen, die die Aufnahme von Nährstoffen in Hühnern effizienter gestalten. Moderne Sequenzierungstechnologien haben uns an einem Punkt geführt, bei dem die Gewinnung von Informationen aus mikrobiellen Ökosystemen nur den Beginn eines Prozesses darstellt, bei dem es schlussendlich darum geht relevante Mikroorganismen und ihre Rolle innerhalb des Ökosystems zu erfassen. Die Herausforderung besteht dabei darin, dieser enormen Menge an Information einen Sinn zu geben und geeignete bioinformatische Pipelines zu etablieren, um die Sequenzen schnell und präzise zu verarbeiten und in angemessenem biologischen Kontext auszuwerten. Das Hauptziel dieser Arbeit bestand darin, die Veränderungen in der bakteriellen Gemeinschaftsstruktur von Hühnern, als Reaktion auf verschiedene experimentelle Diäten, zu beschreiben.
Der erste Teil dieser Arbeit beinhaltet eine Zusammenfassung des aktuellen Stands der Forschung bzgl. der Mikrobiota des Magendarmtraktes von Hühnern. Die Zusammensetzung und Funktionalität werden dabei mit modernsten Methoden untersucht, welche taxonomische Information auf DNA-Ebene unter Verwendung des 16S-rRNA-Gens bereitstellen. Genkataloge werden via Schrotflinten-Metagenom-Sequenzierung erstellt, eine Technik, die noch in den Kinderschuhen steckt, was über die limitierte Verfügbarkeit von nur acht veröffentlichten Publikationen nochmals verdeutlicht wird. Auf Proteinebene wurden nur zwei Studien gefunden, die metaproteomische Daten beinhalten. Aufgrund des technologischen Fortschritts, haben sich viele Forschungsgruppen darauf konzentriert, die Auswirkungen von Futterergänzungen auf die Mikroben in den verschiedenen Sektionen des Magendarmtraktes wie dem Kropf, Proventrikulus, Muskelmagen, Jejunum, Ileum, Caeca und dem Kot zu untersuchen. Zu den häufigsten Futteradditiven zählen einzelne Enzyme, aber auch komplexer Enzymmischungen sowie organische Säuren, Mineralien, Präbiotika, Probiotika und Synbiotika (wie die kombinierten Wirkungen von Prä- und Probiotika).
Der zweite Teil, der in Kapitel 3 vorgestellt wird, beinhaltet eine umfassende Untersuchung der Mikrobiota in Proben von Digesta und Schleimhäuten individueller Broiler unter Einfluss von variierender Futterzusätze in Form von Calcium (Ca), Phosphor (P) und Phytase. Der Einfluß der Futterzusammensetzung auf die Struktur der mikrobiellen Gemeinschaften wurde im Kropf, Ileum und Caecum via Illumina-Sequenzierung der V1-2-Region des 16S-rRNA-Gens untersucht. Dabei stellte die hohe individuelle Variabilität der mikrobiellen Zusammensetzung zwischen den einzelnen Tieren eine grundlegende Erkenntnis dar. Signifikante Unterschiede wurden zwischen den Digesta- und Mucosaproben beobachtet, was die Hypothese stützt, dass Mucosa-assoziierte Gemeinschaften, in engerem Verbund mit dem Wirt, eine abweichende Struktur aufweisen. Des Weiteren wurde ein Effekt der Calciumsupplementierung auf die Tierleistung beobachtet, wobei die Werte für die Körpergewichtszunahme und die Futterumsetzung im Vergleich zu den anderen Behandlungen abnahmen. Die mikrobielle Gemeinschaften der Kropfschleimhaut wurden ebenfalls von der Diät beeinflusst, während in den Digestaproben keine signifikanten Veränderungen ersichtlich waren. Die Zugabe von Phosphor zeigte einen signifikanten Einfluss auf die mikrobielle Gemeinschaftstruktur in Proben der Ileummukosa. Im Vergleich mit den Proben des Ileums und des Kropfes, wiesen die Blinddarmproben eine höhere Diversität auf und zeigten ebenfalls eine höhere Abundanz von Buttersäure-produzierenden Bakterien. Eine geringere mikrobielle Diversität im Kropf war mit einer geringeren Wachstumsleistung bei der Supplementierung von Ca verbunden. Alle angewandten Futtermittelzusammensetzungen beeinflussten die mikrobielle Gemeinschaftsstruktur. Jedoch zeigt keine der diätetischen Behandlungen eine konsistente Wirkung über die untersuchten Magendarmabschnitte hinweg.
Zusätzlich wurde der Effekt verschiedener Proteasen und einer Phytase auf die mikrobielle Gemeinschaft des Ileums von Masthühnern untersucht. Kapitel 4 behandelt den Einfluss verschiedener Enzymzusätze auf die Zusammensetzung der Mikrobiota im Ileum von Masthühnern und untersucht, ob diese Effekte mit Unterschieden in der praecaecalen Verdaulichkeit von AA zusammenhingen. Der Zusatz von drei verschiedene Proteasen, in niedriger und hoher Konzentration wurde untersucht: Protease A (Meiji), Protease B (Cibenza) und Protease C (Ronozyme ProAct). Außerdem wurde eine Phytase (Natuphos E) zugesetz. Die mikrobielle Taxonomie wurde durch 16S-rRNA-Gen-Illumina-Amplikon-Sequenzierung untersucht. Die Leistungsergebnisse zeigten eine signifikante Zunahme des Wachstums und der Futtereffizienz bei Broilern, die mit Phytase gefüttert wurden oder hohen Dosierungen der Protease C erhielten. Der Großteil der AA zeigte einen signifikanten Unterschied zwischen der Kontrolldiät und der Supplementierung mit Protease C in hohen Dosierungen sowie einen Effekt der Phytasezugabe. Effekte auf die Mikrobiotazusammensetzung wurden auf Gattungsniveau für einige Protease- und Phytase-Ergänzungen beobachtet. Die Genera Streptococcus, Lactobacillus und unbekannte Clostridiaceae waren für diese Unterschiede verantwortlich. Diese Studie zeigt, dass Enzymsupplementierungseffekte die Zusammensetzung der Enddarmdarmmikrobiota und in geringerem Ausmaß auch die praecaecalen Verdaulichkeit von AA bedingte. Die Veränderungen in der Zusammensetzung der Mikrobiota und der praecaecalen Verdaulichkeit von AA konnten jedoch nicht korreliert werden, was auf das Fehlen einer kausalen Beziehung hinweist.
Schließlich wird in Kapitel 5 ein Ausblick bzgl. Metagenomsequenzierung vorgestellt, um das Ergebnis der Fütterungsstrategien detaillierter zu beschreiben. Die Caeca-Proben aus Kapitel 3, einschließlich Mucosa und Digesta, aus der Kontrollbehandlung und Mineral ergänzten Diäten wurden untersucht. Es wurden signifikante Unterschiede in den Funktionsprofilen zwischen Digesta und Mucosa Proben beobachtet. Daten des Wirtsmetabolismus, die für mikrobielle Aktivitäten essentiell sind, zeigten 50% der relevaten Gene in den ergänzten Diäten, während die Kontrollgruppen nur 40% aufzeigten. Die ergänzten Futtermittel zeigten einen erhöhten Aktivität des Phosphatase-Stoffwechselweg und der Butyratproduktion, während der Calcium-Signalweg in den Kontrollen aktiver war.
Zusammenfassend wurde im Rahmen dieses Projekts eine Standardisierungsmethode zur Untersuchung der Mikrobiota im Magen-Darm-Trakt von Broilern etabliert. Die Ergebnisse zeigten einen signifikanten Einfluss von Enzym- und Mineralsupplementation auf die Zusammensetzung der Mikrobiota in den einzelnen Abschnitten des GIT. Es konnte auch gezeigt werden, dass selbst wenn der Madendarmtrakt als verbundenes System funktioniert, seine Abschnitte verschiedene Umweltbedingungen darstellen, die wiederum die Mikrobiota beeinflussen. Diese Studie liefert Einblicke in die Reaktionen der Bakterien und deren Funktionalität auf verschiedene Futterergänzungen.

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