Optimierung der Kulturbedingungen zur definierten Differenzierung, Langzeit- und Co-Kultur von Adipose-derived stem cells zum Aufbau eines Fettgewebemodells

Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:100-opus-15556
URL: http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2019/1555/

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SWD-Schlagwörter:		Fettzelle
Freie Schlagwörter (Deutsch):		Co-Kultur , vaskularisiertes Fettgewebe , definiert , serumfrei
Freie Schlagwörter (Englisch):		adipocyte , co-culture , vascularized adipose tissue , defined, serum-free
Institut:		Institut für Biologische Chemie und Ernährungswissenschaft
Fakultät:		Fakultät Naturwissenschaften
DDC-Sachgruppe:		Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart:		Dissertation
Hauptberichter:		Kluger, Petra Juliane Prof. Dr. rer. nat.
Sprache:		Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung:		28.06.2018
Erstellungsjahr:		2018
Publikationsdatum:		22.01.2019
Lizenz:		Veröffentlichungsvertrag mit der Universitätsbibliothek Hohenheim
Kurzfassung auf Englisch:		Most current attempts in engineering adipose tissue are based on the supplementation with human or animal-derived sera. However, especially the use of animal-derived serum is linked to many disadvantages, like potential contaminations, ethical issues and in general the missing identification of many ingredients. Therefore, serum supplementation impedes the actual application of engineered adipose tissue constructs as implants, to substitute lost tissue after tumor resection, severe burnings or trauma. Equally, due to a potential cover up of the cellular response by unidentified components, it impairs the in vitro use of such models as test systems to elucidate mechanisms of disease development, screen for new drugs or generally assess pharmaceutical safety levels. To be capable for functional anastomosis with the host tissue after implantation and for the use in time- and maturation-dependent in vitro purposes, engineered constructs have to exhibit a minimum sustainability. So far, only few authors addressed the serum-free, defined differentiation of adipocytes. And there are hardly any trials available on the defined maintenance of adipocytes. In this study, the development of a defined culture medium for the adipogenic differentiation of primary human adipose-derived stem cells (ASCs) was aimed. Based on the addition of specific factors for the replacement of serum, ASCs were differentiated to viable and characteristic adipocytes for 14 days, which was proven through the accumulation of lipids, the expression of perilipin A and by the release of leptin and glycerol. Furthermore, a defined maintenance medium was developed, which supported the maturation and stability of cells for a long-term period of additional 42 days until day 56. In order to pursue the goal of a physiological tissue substitute of relevant size, the integration of a vascular component is of fundamental importance to allow sufficient nutrient supply of all peripheral tissue areas. For this purpose, a natural vascular system based on a cellular component would be ideal. Due to the lack of an adequate co-culture medium, a major challenge in adipose tissue vascularization is represented by the setup of an adipocyte/endothelial cell (EC) co-culture. In this study, the development of a tissue-tailored co-culture medium based on adipocyte- and EC-factors was developed. Thereby the critical role of epidermal growth factor (EGF) and hydrocortisone (HC) in adipocyte/microvascular (mv)EC co-culture was determined. Through the adjustment of their supplementation, a functional co-culture of adipocytes and mvECs was achieved. In there, mvECs maintained the cell-specific expression of von Willebrand factor (vWF) and cluster of differentiation 31 (CD31). Additionally, cells kept their ability to incorporate acetylated low density lipoprotein (acLDL). By combining the experiences from both mentioned attempts, a defined adipocyte/EC co-culture medium was developed. Next to the maintenance of functional and characteristic adipocytes, the medium facilitated the formation of vascular-like structures in the direct co-culture. To be able to establish tissue constructs of relevant size, current in vitro attempts have to be transferred to a three-dimensional (3D) environment. In this trial, a 3D adipose tissue model was set up based on the differentiation of ASCs in a collagen type I hydrogel in co-culture with mvECs for 21 days in total. The comparison of these models with native adipose tissue demonstrated high accordance in the gene expression levels related to differentiation and fatty acid metabolism. Some deviations were found mostly in maturation-dependent genes linked to tissue functionality and angiogenic mediation. Differentiation and the maintenance of a homeostatic tissue state highly rely on the physical and chemical characteristics of the applied scaffold. As another part, the influence of a novel cellulose-based material (CBM) on defined adipogenic differentiation of ASCs and the defined maintenance of mvECs was investigated in this thesis. An accelerating effect of CBM on the defined differentiation of ASCs was proven by enhanced release of leptin and the increased expression of perilipin A. CBM was further shown to facilitate the formation of vascular-like structures by mvECs under defined conditions in the absence of another supporting cell type. Additionally, the successful co-culture of adipocytes and mvECs was demonstrated on CBM under defined conditions. Summarized, defined culture media for the differentiation, maintenance and co-culture of primary ASC and mvECs were developed. The supporting effect of CBM on the defined establishment of cultures was proven. Further the successful setup of a 3D adipocyte/mvEC co-culture model with a high predictive power was shown. Combined these achievements can be used for the in vitro setup of a 3D vascularized adipose tissue under defined conditions.
Kurzfassung auf Deutsch:		Die meisten aktuellen Ansätze zum Aufbau eines künstlichen Fettgewebekonstruktes basieren auf dem Einsatz von Blutseren. Speziell die Verwendung von tierischem Serum ist jedoch mit vielen Nachteilen verbunden. Dazu zählen potentielle Kontaminationen, große Variationen zwischen den Chargen und die vielen, nicht identifizierten Komponenten. Die Supplementierung mit Serum behindert so den Einsatz von künstlichen Fettgewebekonstrukten als Implantat zum Ersatz von Gewebe nach einer Tumorentfernung, schweren Verbrennungen oder Traumata. In vitro Ansätze z.B. zur Aufklärung von Krankheitsentstehungen, der Entwicklung oder Sicherheitseinstufung von Medikamenten, basieren auf der zellulären Antwort, welche ebenfalls durch Serum-Komponenten verschleiert werden kann. Zudem sollten Fettgewebekonstrukte eine grundsätzliche Stabilität aufweisen um nach der Implantation eine ausreichende Anastomose mit dem Empfängergewebe und die Nutzung für zeit- und reifeabhängige in vitro Fragestellungen zu ermöglichen. Die definierte serumfreie Differenzierung von Adipozyten wurde bisher nur von wenigen Autoren adressiert. In dieser Arbeit wurde die Entwicklung definierter Kulturmedien für die adipogene Differenzierung humaner primärer Stammzellen aus dem Fettgewebe (adipose-derived stem cells, ASCs) angestrebt. Durch die Zugabe von spezifischen Faktoren als Alternative zu Serum, erfolgte eine 14-tägige Differenzierung zu viablen und charakteristischen Adipozyten, was sich durch die Einlagerung von Lipiden, der Expression von Perilipin A und der Freisetzung von Leptin und Glycerol bestätigen ließ. Weiterhin wurde ein definiertes Erhaltungsmedium entwickelt, welches die Reifung der Adipozyten über einen Kulturzeitraum von 42 Tagen bis zu Tag 56 unterstützte. Zur ausreichenden Versorgung, auch peripher gelegener Geweberegionen, ist die Integration einer vaskulären Komponente beim Aufbau eines physiologischen Gewebeersatzes in relevanter Größe fundamental. Idealerweise sollte das vaskuläre System aus einer natürlichen, zellulären Komponente bestehen. Durch den Mangel eines adäquaten Co-Kulturmediums, stellt der Aufbau einer Adipozyten/Endothelzell (endothelial cell, EC) Co-Kultur bei der Vaskularisierung von Fettgewebe eine zentrale Herausforderung dar. In dieser Arbeit wurde ein gewebespezifisches Co-Kulturmedium mit Adipozyten- und EC-Faktoren entwickelt. Hierbei zeigte sich die kritische Rolle vom epidermalen Wachstumsfaktor (epidermal growth factor, EGF) und Hydrocortison (HC) in der Co-Kultur von Adipozyten und mikrovaskulären (mv)EC. Durch die Supplementanpassung ließ sich eine funktionelle Adipozyten/mvEC Co-Kultur aufbauen. Darin erhielten die mvECs die zellspezifische Expression des von Willebrand Faktors (vWF) und des Oberflächenmarkers 31 (Cluster of differentiation, CD31). Außerdem behielten sie die Fähigkeit zur Aufnahme von acetyliertem Lipoprotein niedriger Dichte (acetylated low density liporotein, acLDL). Durch die Erkenntnisse aus beiden Ansätzen ließ sich ein definiertes Adipozyten/EC Co-Kultur-medium entwickeln. Neben dem Erhalt funktioneller und charakteristischer Adipozyten, unterstütze das Medium in direkter Co-Kultur die Ausbildung vaskulärer Strukturen. Zum Aufbau von Gewebekonstrukten relevanter Größe ist die Überführung der aktuellen Ansätze in eine dreidimensionale (3D) Umgebung notwendig. In dieser Thesis wurde ein 3D Fettgewebekonstrukt mit differenzierten ASCs in einem Kollagen Typ I Hydrogel in Co-Kultur mit mvECs über 21 Tage aufgebaut. Im Vergleich der Modelle mit nativem Gewebe zeigte sich eine größtenteils übereinstimmende Expression von Genen, die mit der Differenzierung und dem Fettstoffwechsel verbunden sind. Abweichungen wurden hingegen bei zumeist reifeabhängigen Genen, die im Zusammenhang mit der Gewebefunktionalität und angiogenen Prozessen stehen, festgestellt. Die Differenzierung und eine homeostatische Gewebeerhaltung hängen maßgeblich von den physikalischen und chemischen Eigenschaften des eingesetzten Biomaterials ab. In einem weiteren Teil dieser Thesis wurde der Einfluss eines neuartigen Cellulose-basierten Materials (CBM) auf die definierte adipogene Differenzierung und die definierte mvEC Erhaltung untersucht. Die erhöhte Ausschüttung von Leptin und die Expression von Perilipin A zeigte einen beschleunigenden Effekt von CBM auf die Differenzierung von ASCs. Weiterhin ermöglichte CBM die Ausbildung vaskulärer Strukturen in der definierten Kultur ohne die Unterstützung weiterer Zelltypen. Schließlich gelang die definierte Co-Kultur von Adipozyten und mvECs auf CBM. Zusammengefasst wurden in dieser Arbeit definierte Medien zur Differenzierung, Erhaltung und Co-Kultur von primären ASCs mit mvECs entwickelt. CBM zeigte einen unterstützenden Effekt im definierten Ansatz dieser Kulturen. Außerdem gelang der Aufbau einer 3D Adipozyten/mvEC Co-Kultur. In Kombination können diese Ergebnisse zum Aufbau eines vaskularisierten 3D Fettgewebekonstruktes unter definierten Bedingungen genutzt werden.

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