Universität Hohenheim

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Alpmann, Alexander

Trace analysis of acrylamide by high-performance thin-layer chromatography coupled to mass spectrometry

Spurenanalyse von Acrylamid mittels HPTLC gekoppelt mit MS


Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:100-opus-6609
URL: http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2012/660/

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SWD-Schlagwörter: Acrylamid , Planarchromatographie , Trinkwasser , Kaffee , Kopplung <Analytische Chemie> , Massenspektrometrie
Freie Schlagwörter (Deutsch): Fluoreszenzdetektion
Freie Schlagwörter (Englisch): fluorescence detection
Institut: Institut für Lebensmittelchemie
Fakultät: Fakultät Naturwissenschaften
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Schwack, Wolfgang Prof. Dr.
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 21.06.2011
Erstellungsjahr: 2011
Publikationsdatum: 12.03.2012
Lizenz: Hohenheimer Lizenzvertrag Veröffentlichungsvertrag mit der Universitätsbibliothek Hohenheim
Kurzfassung auf Englisch: Planar-chromatography (High-Performance Thin-Layer Chromatography, HPTLC) is a rapid and cost-effective offline separation method. Through advances in the automatization of each step the system reproducibility, from application and development to detection, has been improved. This makes planar-chromatography a highly reliable technique. HPTLC shows a couple of features that make it unique. There is great flexibility concerning application, development and detection that distinguishes HPTLC from other techniques. Especially the parallel development of up to 36 tracks per plate, the possibility of pre-chromatographic derivatization on the stationary phase, application volumes from nL up to mL, two-dimensional development, automated single or multiple development, and the multiple detection with different methods (UV, fluorescence, bioluminescence, etc.) have to be emphasized. A further advantage over column- (LC) and gas-chromatography (GC) is the single use of the stationary phase. This leads to a high tolerance towards sample matrix and allows for reducing sample preparation. Because of these aspects, planar-chromatography is an interesting tool for each analyst.
However, in the last years hyphenation with mass spectrometry (MS) did not make great advancements in comparison to HPLC and GC: thus, planar-chromatography became less attractive. Therefore an existing universal hyphenation (ChromeXtract by Dr. Luftmann), that was based upon a plunger for elution, was improved (publication 1). The original version of the plunger did not allow any elution from glass backed plates, since they broke easily under the pressure applied during clamping. It was difficult to adjust the pressure depending on the experience of the operator. Furthermore, solvent leakage was possible because of insufficient sealing of the cup-point. For a reproducible contact pressure that was independent from the experience of the operator, a commercial torque wrench was used for clamping of the plates. This guaranteed reproducible contact pressure. The installation of a small plastic buffer into the plunger ensured a slight kind of attenuation. This decreased the frequency of leakage from over 50 % to below 5 %.
An important criterion of applicability of this hyphenation is the repeatability of the extractions and thus the measurements. Thus, zones of xanthylethylcarbamat (XEC) and dansylpropanamid (DPA) were extracted after chromatographic development. Their specific masses were detected in positive ESI-mode. The relative standard deviation of the signal in single-ion-monitoring (SIM) mode was 18.6 % for XEC and 8.7 % for DPA. Linearity was given in the range of 10 to 200 ng/zone with a very good correlation coefficient (r > 0.9919). The limit of quantification at an S/N-ratio of 10 was calculated by means of the blank signal and amounted 52 and 160 pg/zone for XEC and DPA, respectively. Additionally, the influence of the elution solvent on the extraction of the HPTLC-plate and signal intensity was demonstrated with tests using different solvents.
The second publication addressed the application of planar-chromatography hyphenated with MS by means of the modified ChromeXtractor on the determination of acrylamide in drinking water. The strict limit within the EU of 0.1 mug/L until then was only controlled through costly methods that were almost exclusively based on GC-MS or LC-MS/MS after applying intensive clean-up procedures. Thus it was aimed to develop a low priced and rapid alternative method for routine analysis based on HPTLC. Therefore a pre-chromatographic in-situ derivatization of acrylamide with a fluorescence marker was used. The product was detected densitometrically after chromatographic separation. During development of the method, the mass of the reaction product was determined for analysis of the derivatization step. With the aid of the modified ChromeXtract the product could be directly extracted from the plate and transferred to MS. The exact mass proved that instead of the originally used fluorescence marker dansylhydrazine the dimethylaminonaphthaline(Dan)-sulfinic acid reacts with acrylamide. Consequently, dansulfinic acid was synthesized and used for derivatization.
To take advantage of the high tolerance of planar-chromatography towards various sample matrices, an approach was searched in order to skip sample preparation. However the necessity to use excess of reagent led to high background fluorescence. This allowed only a limit of detection of 20 mug/L. Thus, sample preparation and analyt enrichment was necessary to obtain a method able to control the maximum concentration. In accordance with DIN 38413-6 concerning determination of acrylamide in drinking water, activated carbon was used for analyte enrichment by means of solid phase extraction (SPE). An internal standard (dimethylacrylamide) was added prior sample preparation. The final extract was analysed as described. In spiked samples of drinking water, a 1000-fold lower limit of detection of 0.02 mug/L and a very good mean reproducibility across the whole system was shown, which suffices to control the maximum amount. A comparative study with measurements by LC-MS/MS revealed satisfactory correlation. Thus, for the first time a planar-chromatographic method for the determination of acrylamide at ultra-trace levels were presented.
The third publication addresses the application of the developed method on a very complex food matrix like coffee. Several publications reported problems during determination of acrylamide in coffee. Therefore the extremely high tolerance of planar-chromatography towards sample matrix effects was used, allowing for a shortened sample preparation. The idea of a rapid method was followed by the extraction of commercial coffee samples by means of accelerated solvent extraction (ASE). This allowed for higher throughput during sample preparation. To remove a part of the co extracted matrix, the whole ASE-extract was cleaned by SPE with activated carbon and evaporated to a defined volume. This represented a simplification of common multistage extraction methods and clean-up steps, that aim for complete removal of co extracted matrix prior injection into LC- or GC-systems. In accordance with determination of acrylamide in drinking water, the extract was derivatized in-situ with the fluorescence marker Dansulfinic acid and detected densitometrically after chromatographic separation. The concentration of acrylamide was quantified by means of parallel preparation of three standard additions. Systematic errors and the influence of the sample were corrected by the calibration within the matrix. The linearity of the calibration (between r = 0.9825 and 0.9995) were acceptable. Good values were reached for the limit of quantification (48 mug/kg) and repeatability (rsd 3 %). After method development the acrylamide concentration of commercial coffee samples was determined, showing results being consistent with literature findings. Thus the applicability of the newly developed method to complex food samples was demonstrated.
In summary, the present work shows the applicability of planar-chromatography hyphenated with mass spectrometry for sensitive determination of acrylamide. It was possible to quantify the analyte at ultra-trace levels using less instrumental effort and time than usual. Quantification in complex sample matrices was feasible in spite of a simplified sample preparation. These applications prove the relevance of planar-chromatography to solve current analytical problems.
Kurzfassung auf Deutsch: Bei der Planar-Chromatographie (High-Performance Thin-Layer Chromatography, HPTLC) handelt es sich um eine schnelle und kosteneffektive offline Trenntechnik. Die Entwicklungen in der Automatisierung der einzelnen Schritte führten zu einer stetigen Verbesserung der Reproduzierbarkeit von der Auftragung über die Entwicklung bis hin zur Detektion. Dies macht die Planar-Chromatographie zu einer zuverlässigen Analysetechnik. Unter mehreren Gesichtspunkten ist die HPTLC eine besondere Technik. Ihre extreme Flexibilität in der Auftragung, Entwicklung und Detektion heben sie von anderen Techniken hervor. Die parallele Entwicklung von bis zu 36 Banden pro Platte, die Möglichkeit zur prächromatographischen Derivatisierung auf der stationären Phase, mögliche Auftragsvolumina von nL bis mL, zweidimensionale Entwicklung, automatisierte Einfach- und Mehrfachentwicklung und die mehrfache Detektion einer Platte mit verschiedenen Techniken (UV, Fluoreszenz, Biolumineszenz, etc.) sind dabei hervorzuheben. Ein weiterer Vorteil gegenüber der Säulen- (LC) oder Gas-Chromatographie (GC) ist die einmalige Benutzung der stationären Phase. Dies hat eine sehr hohe Toleranz gegenüber Probenmatrix und damit verbunden eine verringerte Probenaufarbeitung zur Folge. Dies alles macht die Planar-Chromatographie für den Analytiker zu einer interessanten Analysetechnik.
Jedoch machte in den letzten Jahren die Kopplung mit der Massenspektrometrie (MS) nicht den glei-chen Fortschritt, wie bei der HPLC und GC, wodurch die Planar-Chromatographie an Attraktivität verlor. Es wurde daher eine vorhandene universelle Kopplungsmöglichkeit (ChromeXtract von Dr. Luftmann), die auf einem Elutionsstempel basierte, verbessert (Publikation 1). Die ursprüngliche Version des Elutionsstempel liess keine Anwendung auf Glasplatten zu, da diese beim Einspannen schnell unter dem Anpressdruck des Stempels zerbrachen. Der Anpressdruck des Stempels liess sich nur schwer regulieren und war von der Erfahrung des Anwenders abhängig. Des Weiteren konnte ein Auslaufen des verwendeten Lösungsmittels durch unzureichende Abdichtung der Zone durch die Ringschneide auftreten. Um den Anpressdruck reproduzierbar und unabhängig vom Benutzer zu machen, wurde ein handelsüblicher Drehmomentschlüssel zum Einspannen der Platte verwendet. Dies garantierte einen reproduzierbaren Anpressdruck beim fixieren. Durch den Einbau eines Kunststoff-Puffers in den Stempel wurde ein leichter Ausgleich beim Anpressen gewährleistet. Dadurch konnte die Häufigkeit des Auslaufens von über 50 % auf unter 5 % gesenkt werden.
Ein wichtiges Kriterium für die Anwendbarkeit der Kopplungsmethode ist die Wiederholbarkeit der Extraktionen und damit auch der Messungen. Hierfür wurden mehrere Zonen der Substanzen Xanthylethylcarbamat (XEC) und Dansylpropanamid (DPA) nach ihrer chromatographischen Entwicklung extrahiert und deren spezifische Massen im positiven ESI-Modus detektiert. Die relative Standardabweichung des Single-Ion-Monitoring (SIM) Signals lag bei 18,6 % für XEC und 8,7 % für DPA. Die Linearität war über einen Bereich von 10 bis 200 ng/Zone bei sehr guten Korrelationskoeffizienten (r > 0.9919) gewährleistet. Anhand des Blindwertsignals konnten die Bestimmungsgrenzen bei einem Signal/Rausch-Verhältnis von 10 zu 52 und 160 pg/Zone für XEC und DPA berechnet werden. Zudem wurde der Einfluss des Elutionsmittels auf die Extraktion der HPTLC-Platte und die Signalintensität anhand von Versuchen mit verschiedenen Lösungsmitteln gezeigt.
Die zweite Publikation befasste sich mit der Anwendung der Planar-Chromatographie gekoppelt mit der MS mittels des modifizierten ChromeXtractors auf die Analyse von Acrylamid in Trinkwasser. Der in der EU geltende strenge Grenzwert von 0,1 mug/L konnte bisher nur von wenigen aufwändigen Bestimmungsmethoden, meist mittels GC-MS oder LC-MS/MS nach intensiver Probenaufbereitung, überprüft werden. Es sollte daher mit der HPTLC eine günstige und schnelle Alternativmethode für die Routine entwickelt werden. Hierfür wurde Acrylamid mit einem Fluoreszenzmarker prä-chromatographisch in-situ derivatisiert und nach chromatographischer Trennung densitometrisch detektiert. Bei der Entwicklung der Methode wurde zur Untersuchung des Derivatisierungsschrittes die Masse des Reaktionsproduktes bestimmt. Mittels modifiziertem ChromeXtract konnte dabei das Produkt direkt von der Platte extrahiert und ins MS geleitet werden. Die exakte Masse half dabei zu erkennen, dass statt des ursprünglich eingesetzten Fluoreszenzmarker Dansylhydrazin dessen Dimethylaminonaphthalin (Dan)-Sulfinsäure mit Acrylamid reagiert. Dies hatte zur Folge, dass Dansulfinsäure gezielt synthetisiert und eingesetzt wurde.
Um die hohe Matrixtoleranz der Planar-Chromatographie zu nutzen, wurde zunächst nach einem Ansatz gesucht, die Probenaufarbeitung zu überspringen. Die Notwendigkeit einen Überschuss des Reagenz für die direkte Umsetzung in der Wasserprobe zu verwenden, führte jedoch im Chromato-gramm zu einer starken Hinergrundfluoreszenz. Dies ermöglichte nur eine Nachweisgrenze von 20 mug/L. Um eine Methode zur Überprüfung des Grenzwertes zu erhalten, war daher eine vorherige Probenaufbereitung und Analytanreicherung nötig. Gemäss der DIN 38413-6 über die Untersuchung von Trinkwasser auf Acrylamid wurde der Analyt unter Verwendung eines internen Standards (Di-methylacrylamid) mittels Festphasenextraktion (Solid Phase Extraction, SPE) an Aktivkohle angereichert und der Extrakt wie beschrieben untersucht. Anhand von dotierten Trinkwasserproben konnte eine um den Faktor 1000 niedrigere Nachweisgrenze von 0,02 mug/L und eine sehr gute durchschnittliche Reproduzierbarkeit über das gesamte System gezeigt werden, was ausreicht den geltenden Grenzwert zu überprüfen. Vergleichsuntersuchungen mit HPLC-MS/MS-Messungen zeigten eine äusserst zufriedenstellende Korrelation. Insgesamt konnte zum ersten Mal eine planar-chromatographische Methode vorgestellt werden, die es ermöglicht, Acrylamid im Ultra-Spurenbereich zu bestimmen.
In der dritten Publikation wurde die entwickelte Bestimmungsmethode auf die sehr komplexe Lebensmittelmatrix Kaffee übertragen, denn es wurde in mehreren Publikationen hierbei von Problemen bei der Acrylamid-Bestimmung berichtet. Hierfür konnte die Matrixtoleranz der Planar-Chromatographie genutzt werden, die eine verkürzte Probenaufarbeitung ermöglichte. Der Ansatz einer schnellen Untersuchungsmethode wurde durch die Extraktion von kommerziell erhältlichen Kaffees mit Hilfe der beschleunigten Lösungsmittelextraktion (Accelerated Solvent Extraction, ASE) weiter verfolgt. Dadurch wurde ein grösserer Probendurchsatz bei der Aufbereitung möglich. Um einen Teil der mit-extrahierten Matrix zu entfernen, wurde der gesamte ASE-Probenextrakt einer SPE mit Aktivkohle unterzogen und anschliessend auf ein definiertes Volumen eingeengt. Dies stellte eine Vereinfachung zu den üblichen mehrstufigen Extraktions- und Aufreinigungsschritten dar, die eine weitestgehende Entfernung der coextrahierten Matrix vor der Injektion in ein HPLC- oder GC-System zum Ziel hatten. Der so vorbereitete Extrakt wurde analog der Bestimmungsmethode für Wasser in-situ mit dem Fluoreszenzmarker Dansulfinsäure umgesetzt und nach chromatographischer Auftrennung densitometrisch erfasst. Durch die parallele Aufarbeitung von drei Standardadditionen konnte der Acrylamidgehalt bestimmt werden. Die Kalibration in der Matrix korrigierte systematische Fehler und Einflüsse der Probe über die gesamte Methode. Die Linearitüt der Kalibrationen (zwischen r = 0.9825 und 0.9995) war akzeptabel. Die Bestimmungsgrenze und Wiederholbarkeit zeigten mit 48 mug/kg und 3 % relativer Standardabweichung gute Werte. Nach der Methodenentwicklung wurde von kommerziell erhältlichem Kaffee der Acrylamidgehalt bestimmt, wobei die erhaltenen Werte mit Angaben aus der Literatur übereinstimmten. Es wurde damit die Anwendbarkeit der neu entwickelten Methode auf schwierige Lebensmittel demonstriert.
Zusammengefasst zeigt die vorliegende Arbeit die Anwendbarkeit der Planar-Chromatographie in Verbindung mit der Massenspektrometrie für die empfindliche Bestimmung von Acrylamid. Es ist gelungen, mit einem Bruchteil des üblichen apparativen und zeitlichen Aufwands den Analyten zum einen bis hin zum Ultra-Spurenbereich zu quantifizieren. Des weiteren wurde trotz einer verkürzten Probenaufarbeitung die Quantifizierung in einer problematischen Matrix möglich. Diese Anwendungen stellen die Relevanz der Planar-Chromatographie für moderne analytische Fragestellungen unter Beweis.

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