Establishment of a new in vitro culture system and functional analysis of sonic hedgehog and FGF8 in the determination of laterality in the rabbit embryo

Bitzer, Eva

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Bitzer, Eva

Establishment of a new in vitro culture system and functional analysis of sonic hedgehog and FGF8 in the determination of laterality in the rabbit embryo

Etablierung einer neuen in vitro Kulturmethode und funktionelle Analyse von Sonic Hedgehog und FGF8 bei der Entstehung von Lateralität im Kaninchenembryo

(Übersetzungstitel)

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URN: urn:nbn:de:bsz:100-opus-3432
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SWD-Schlagwörter:

In-vitro-Kultur , Kaninchen

Freie Schlagwörter (Deutsch):

Kaninchen , in vitro Kultur , Shh , FGF8 , links-rechts Asymmetrie

Freie Schlagwörter (Englisch):

rabbit , in vitro culture , Shh , FGF8 , left-right asymmetry

Institut:

Institut für Zoologie

Fakultät:

Fakultät Naturwissenschaften

DDC-Sachgruppe:

Tiere (Zoologie)

Dokumentart:

Dissertation

Hauptberichter:

Blum, Martin Prof. Dr.

Sprache:

Englisch

Tag der mündlichen Prüfung:

29.01.2009

Erstellungsjahr:

2008

Publikationsdatum:

12.03.2009

Lizenz:

Veröffentlichungsvertrag mit der Universitätsbibliothek Hohenheim ohne Print-on-Demand

Kurzfassung auf Englisch:

Cilia-driven leftward flow plays a pivotal role in the determination of left-right (LR) asymmetry. In mammals, this extracellular fluid flow is produced by motile monocilia situated on the posterior notochordal plate (PNC). The PNC is homologous to superficial mesoderm derived structures of other species like the gastrocoel roof plate (GRP) in frog and Kupffer's vesicle (KV) in fish. Directional fluid flow created at these structures subsequently leads to the initiation of the left-specifying Nodal signalling cascade in the left lateral plate (LPM). The rabbit develops via a flat blastodisc phase representing the archetypical mode of mammalian embryogenesis. These specific advantages of the rabbit were employed in this study to further examine the role of two central determinants of laterality, namely Sonic hedgehog (Shh) and FGF8, and also extended by the design of a new in vitro culture technique. In this new method, the so-called ring culture, a medium-filled plastic ring was placed upon the extraembryonic tissue of the explanted embryo. In contrast to the semi-dry standard culture method, this setting corresponded more to the in vivo conditions of gastrulating/neurulating rabbit embryos in the uterus. It therefore facilitated stable development of laterality in most cases also when presomite stages were taken into culture. Subsequent analysis showed that this was due to improved development of the PNC. Conversely, in standard-cultured embryos showing altered LR marker gene expression, maturation of the PNC was impaired leading to a disturbance of leftward flow. This study also provided evidence that cilia-driven leftward flow is indispensable for the determination of laterality in rabbit embryos. When the flow was blocked during culture by methylcellulose-containing medium embryos displayed altered LR marker gene expression in a very high proportion. The unilateral gain-of-function of Shh revealed important differences between rabbit and chick embryos. In rabbit, Shh induced right-sided marker gene expression only in the 2 somite stage, whereas in chick this inductive effect lasted from stage 4 until up to the 1-2 somite stage. This indicated that in rabbit Shh works in conjunction with the flow, which has not been described up to now in chick. The systemic inhibition of Shh signalling by cyclopamine led to bilateral expression of LR marker genes in rabbit. This was due to disruption of the floor plate and therefore the loss of the restrictive midline barrier function of Lefty expression as described in Shh mutant mice. FGF8 has a right-sided repressive function in the rabbit implicated in the transfer of laterality cues. In the present study it could be shown that this repressive effect is epistatic to cilia-driven leftward flow, because it also functioned when the flow was blocked. The systemic inhibition of FGF8 signalling with SU5402 caused loss of LR marker gene expression prior to the 2 somite stage but did not influence ciliogenesis or the setup of cilia-driven leftward flow. Taken together, this suggested a dual function for FGF8 signalling: First, it is needed to confer competence to the lateral plate and second, during the 2 somite stage, it is needed for the transfer of LR cues.

Kurzfassung auf Deutsch:

Bei der Entstehung der links-rechts (LR) Asymmetrie spielt ein von Cilien getriebener, linksgerichteter Flüssigkeitsstrom (CLF) eine entscheidende Rolle. In Säugern wird dieser extrazelluläre Flüssigkeitsstrom von motilen Monocilien auf der posterioren Notochordplatte (PNC) erzeugt. Das PNC ist homolog zu den ebenfalls aus superfiziellem Mesoderm hervorgehenden Strukturen anderer Spezies wie der Dachplatte des Gastrocoels (GRP) der Amphibien und dem Kupfferschen Vesikel (KV) des Fisches. Der in diesen Strukturen entstehende CLF führt schließlich zur Aktivierung der links-spezifizierenden Nodal-Signalkaskade im linken Seitenplatten-mesoderm (LPM). Das Kaninchen entwickelt sich über ein flaches Keimscheibenstadium und repräsentiert somit den ursprünglichen Modus der Säugerentwickung. Diese besonderen Vorteile des Kaninchens wurden in der vorliegenden Arbeit genutzt, um die Rolle zweier wichtiger Lateralitätsdeterminanten, Sonic hedgehog (Shh) und FGF8, weiter zu untersuchen. Außerdem wurden die experimentellen Möglichleiten durch die Entwicklung einer neuen in vitro Kulturmethode erweitert. Bei dieser so genannten Ringkulturmethode wurde ein mit Medium gefüllter Plastikring auf das extraembryonale Gewebe des explantierten Embryos gelegt. Im Gegensatz zur halbtrockenen Standardkulturmethode entspricht dies mehr den in vivo Gegebenheiten eines Kaninchen Embryos im Uterus. Dies ermöglichte daher meist eine stabile Entwicklung der Lateralität auch bei der Kultivierung von präsomitischen Stadien. Nachfolgende Untersuchungen zeigten, dass dies mit einer verbesserten Entwicklung des PNC zusammen hing. Umgekehrt war bei Standardkultivierten Embryonen, die veränderte LR Markergenexpression zeigten, die Entwicklung des PNC und nachfolgend des CLF beeinträchtigt. In der vorliegenden Arbeit konnte ebenfalls gezeigt werden, dass der von Cilien getriebene Flüssigkeitsstrom unverzichtbar für die Entstehung von Asymmetrie in Kaninchenembryonen ist. Wurde der CLF während der Kultivierung durch methylcellulosehaltiges Medium blockiert, so zeigte ein großer Anteil der so behandelten Embryonen anschließend veränderte Markergenexpression.
Der unilaterale Funktionsgewinn von Shh konnte wichtige Unterschiede zwischen Kaninchen- und Hühnerembryonen aufzeigen. Im Kaninchen wurde nur während des 2-Somiten-Stadiums rechtsseitige Markergenexpression durch Shh induziert, wohingegen im Huhn dieser induktive Effekt von Stadium 4 bis bis hin zum 1-2 Somiten-Stadium zu beobachten war. Dies legte nahe, dass Shh im Kaninchen in Verbindung mit dem CLF wirkte, der bisher im Huhn nicht beschrieben wurde. Die systemische Inhibition des Shh Signalwegs verursachte bilaterale Expression von LR Markergenen im Kaninchen. Dies konnte auf eine Störung der neuralen Bodenplatte und damit auf ein Fehlen der restriktiven Lefty Expression zurückgeführt werden, wie bereits für Shh mutante Mäuse beschrieben.
FGF8 besitzt eine rechtsseitige repressive Wirkung im Kaninchen, die am Transfer von Lateralitätssignalen beteiligt ist. In der vorliegenden Arbeit konnte nun gezeigt werden, dass dieser repressive Effekt epistatisch zum CLF ist, da der Effekt erhalten blieb auch wenn dieser blockiert war. Die systemische Inhibition des FGF8 Signalwegs durch SU5402 bewirkte den Verlust von LR Markergenexpression in Embryonen vor dem 2-Somiten-Stadium, beeinflusste die Ciliogenese bzw. die Entstehung des CLF jedoch nicht. Zusammenfassend deutete dies auf eine duale Funktion des FGF8 Signalweges hin: Es wird zuerst für die Übertragung von Kompetenz auf die Seitenplatten sowie später, im 2-Somiten-Stadium, für den Transfer von Lateralitätssignalen gebraucht.