Isolierung und funktionelle Charakterisierung von Einzelkomponenten des Gifts der südamerikanischen Klapperschlange Crotalus durissus terrificus

Kaltenbach, Stefan

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Kaltenbach, Stefan

Isolierung und funktionelle Charakterisierung von Einzelkomponenten des Gifts der südamerikanischen Klapperschlange Crotalus durissus terrificus

Isolation and characterization of venom compounds from the South American rattlesnake Crotalus durissus terrificus

Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:100-opus-14406
URL: http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2018/1440/

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SWD-Schlagwörter:

Gift , Cascaval

Freie Schlagwörter (Deutsch):

Crotalus durissus terrificus , Giftkomponenten , Crotamin

Freie Schlagwörter (Englisch):

Crotalus durissus terrificus , venom compounds , crotamine

Institut:

Institut für Physiologie

Fakultät:

Fakultät Naturwissenschaften

DDC-Sachgruppe:

Biowissenschaften, Biologie

Dokumentart:

Dissertation

Hauptberichter:

Hanke, Wolfgang R. L. Prof. Dr.

Sprache:

Deutsch

Tag der mündlichen Prüfung:

15.12.2017

Erstellungsjahr:

2017

Publikationsdatum:

12.02.2018

Lizenz:

Veröffentlichungsvertrag mit der Universitätsbibliothek Hohenheim

Kurzfassung auf Deutsch:

Für das Verständnis der pharmakologischen Aktivität von Proteinen und Peptiden ist es wichtig, den Zusammenhang zwischen Molekülstruktur und Wirkungsweise zu untersuchen. Schlangengifte setzen sich aus einer Vielzahl von Komponenten zusammen, die in unterschiedlichster Weise den Organismus der Beutetiere beeinflussen und schädigen. Sie stellen daher eine reiche Quelle für Substanzen mit biologischer Wirksamkeit dar. Die Isolierung der einzelnen Komponenten bietet somit eine effektive Möglichkeit, pharmakologisch aktive Proteine und Peptide zu gewinnen.
Der Fokus der vorliegenden Arbeit lag auf der Isolierung und Charakterisierung von Einzelkomponenten aus dem Gift der südamerikanischen Klapperschlange Crotalus durissus terrificus. Es konnten zwei der Hauptbestandteile, Crotamin, sowie eine Mischung an Crotoxin B Isoformen, mittels RP-HPLC isoliert und durch massenspektrometrische Untersuchungen identifiziert werden. Im Weiteren lag der Schwerpunkt auf der Charakterisierung der Interaktion von Crotamin mit künstlichen Membranen.
Crotamin ist ein amphiphatisches, hoch basisches Polypeptid mit einer Größe von 4,9 kDa und stark positiver Oberflächenladung. Zunächst als Neurotoxin beschrieben, sind für Crotamin mittlerweile eine Vielzahl weiterer Wirkungen berichtet worden. Zu diesen gehören myotoxische, analgetische, antimikrobielle und antitumorale Effekte. Die Wirkungsweise beruht teilweise auf einer direkten Interaktion mit den Lipiden der Membran. Crotamin werden dabei sowohl membranbeeinflussende Eigenschaften, als auch die Fähigkeit zur Translokation in die Zelle zugeschrieben.
Die vorliegende Arbeit zeigt deutlich den Einfluss der Lipidkomposition von Membranen auf die membranbeeinflussenden Eigenschaften von Crotamin. In Monolayern aus Asolektin führte die Anwesenheit von Cholesterin zu einem langsameren Einbau von Crotamin. Zudem verursachte sowohl die Anwesenheit bivalenter Kationen, als auch die Erhöhung des lateralen Drucks im Monolayer, einen beschleunigten Einbau von Crotamin.
Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass Crotamin die Fluidität von Vesikelmembranen verändert. Bei reinen Asolektinvesikeln führte Crotamin zu festeren, bei DOPC-Vesikeln zu fluideren Membranen. Bei Vesikeln, deren Membran zusätzlich Cholesterin enthielt, führte Crotamin unabhängig von der gewählten Grundsubstanz (Asolektin oder DOPC) zu fluideren Membranen. Das Ausmaß der Fluidisierung war jedoch abhängig von der jeweiligen Cholesterinkonzentration. Je mehr Cholesterin die Vesikelmembranen enthielten, desto geringer die Wirkung von Crotamin. Generell war hierbei der Einfluss der Cholesterinkonzentration bei asolektinhaltigen Vesikeln größer als bei DOPC-haltigen.
Demnach wirkte Cholesterin den membranbeeinflussenden Eigenschaften von Crotamin entgegen. Vermutlich beruhte dies unter anderem auf der geringeren Fluidität von cholesterinhaltigen Membranen. Zudem könnte für die polaren Kopfgruppen der Lipide die Wahrscheinlichkeit zur Interaktion mit kationischen Molekülen wie Crotamin durch die Anwesenheit von Cholesterin verringert sein. Der stärkere Einfluss von Crotamin auf die Fluidität von asolektinhaltigen Membranen könnte auf den, in Asolektin enthaltenen, Lipiden mit negativer Ladung beruhen. Diese könnten, auf Grund einer negativeren Oberflächenladung der Membran, zu einer stärkeren Anziehung von Crotamin führen. Außerdem könnte Crotamin, durch die Interaktion mit negativ geladenen Lipiden, die Bildung von Domänen verursachen.
Die Untersuchungen dieser Arbeit lassen somit den Schluss zu, dass sowohl Cholesterin als auch Lipide mit negativer Ladung die Wirkungsweise von Crotamin auf Membranen verändern. Zudem wird sie durch die Anwesenheit bivalenter Kationen in der umgebenden Lösung und dem lateralen Membrandruck beeinflusst. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass Crotamin die Kalziumhomöostase von neuronalen Zellen beeinflusst. Hierbei verursachte Crotamin einen konzentrationsabhängigen Anstieg der intrazellulären freien Kalziumkonzentration.

Kurzfassung auf Englisch:

In order to understand the pharmacological activities of proteins and peptides it is important to study the relation of their molecular structure and their mode of action. Snake venoms contain a large number of biologically active compounds. They influence and damage the organism of prey in various manners. Therefore, venoms are an abundant source of substances with biological activity. The isolation of these substances is an important way to search for new, pharmacologically active proteins and peptides.
The presented work focused on the isolation and characterization of venom compounds from the South American rattlesnake Crotalus durissus terrificus. Two of its main compounds, crotamine and a mixture of Crotoxin B isoforms, were isolated by RP-HPLC and identified by mass spectrometry. Afterwards, the emphasis was laid on how crotamine interacts with artificial membranes.
Crotamine is a small, amphipathic and highly basic polypeptide with a molecular weight of 4.9 kDa and a high positive surface charge. It used to be described as a neurotoxin, but meanwhile many additional properties have been reported. These include myotoxic, analgetic, antimicrobial and antitumor activities. To some extent, these modes of action are based on the interaction of crotamine with the membrane lipids. In this context, the membrane modifying properties of crotamine and its ability to translocate into cells are under discussion.
The presented work clearly demonstrates that the lipid composition of membranes influences the membrane modifying properties of crotamine. In lipid monolayers built from asolectin, cholesterol had the effect, that crotamine is integrated into the membrane more slowly. Furthermore, it is obvious that the presence of bivalent cations as well as an increasing lateral pressure inside the monolayer leads to a faster integration of crotamine.
Moreover, crotamine altered the membrane fluidity of vesicles. In pure asolectin-vesicles crotamine stiffened the membranes (decreased fluidity), whereas it increased the fluidity in DOPC-vesicles. In vesicles containing a mixture of either asolectin or DOPC and cholesterol, crotamine increased the membrane fluidity, whereby its influence was weakened with rising concentrations of cholesterol. However, the impact of cholesterol was stronger in asolectin:cholesterol-vesicles.
Hence, cholesterol reduces the membrane modifying properties of crotamine. It was assumed that this is due to the fact that cholesterol decrease the fluidity of membranes. Also, cholesterol may reduce the possibility of polar lipid head groups interacting with cationic molecules like crotamine. As asolectin contains negatively charged lipids, it was concluded that these lipids could be responsible for the stronger impact crotamine had on the fluidity of membranes. They could lead to a stronger attraction of crotamine, due to the more negatively charged membrane surface. Negatively charged lipids might also increase the possibility of raft building, caused by crotamine.
In conclusion cholesterol as well as negatively charged lipids alter the effect crotamine has on membranes. It is also influenced by bivalent cations in the surrounding solution as well as the lateral pressure of the membrane. In addition, it was shown that crotamine also affects the calcium homeostasis of neuronal cells. By enlarging the amount of crotamine the internal free calcium concentration also showed an increase.