Untersuchungen zur Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft im Pansen bei der Verwendung von Grassilage und Maissilage

Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:100-opus-14352
URL: http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2018/1435/

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SWD-Schlagwörter:		Pansen , Grassilage , Maissilage
Freie Schlagwörter (Deutsch):		mikrobielle Gemeinschaft im Pansen , tageszeitliche Veränderungen
Freie Schlagwörter (Englisch):		rumen , grass silage , corn silage , ruminal microbial communtiy , diurnal changes
Institut:		Institut für Tierernährung
Fakultät:		Fakultät Agrarwissenschaften
DDC-Sachgruppe:		Landwirtschaft, Veterinärmedizin
Dokumentart:		Dissertation
Hauptberichter:		Rodehutscord, Markus Prof. Dr.
Sprache:		Englisch
Tag der mündlichen Prüfung:		30.01.2017
Erstellungsjahr:		2016
Publikationsdatum:		12.02.2018
Lizenz:		Veröffentlichungsvertrag mit der Universitätsbibliothek Hohenheim
Kurzfassung auf Englisch:		Grass silage and corn silage are the most commonly used silages for feeding dairy cows and fattening bulls. Due to their different chemical composition these silages have diverse effects on the ruminal microbial community and, therefore, on the fermentation process in the rumen. The major objective of this thesis was to evaluate the effect of grass silage and corn silage on the ruminal microbial community composition. The focus was on the incubation of silages without using concentrates. Furthermore, diurnal changes of the ruminal microbial community were investigated. In the first study (Manuscript 1), effects of incubation of grass silage and corn silage on the ruminal microbial community were investigated using an established rumen simulation technique (Rusitec). Furthermore, diurnal changes and changes during the first 48 hours of incubation (adaption phase) were observed. A significant decrease of the complete ruminal microbial community in the fermenter liquids, on species and group level, was observed. During the adaption phase, the silage source lost relevance because in the silage-containing fermenters as well as in the blank fermenters decreasing numbers were observed with the exception of Clostridium aminophilum. For this species, after 48 hours higher numbers were found as compared to the inoculum. As has already been described in the literature, in the current thesis changes in microbial abundance were lesser in feed residues than in fermenter liquids. The abundance of protozoa in feed residues decreased during the first 48 hours while for Prevotella bryantii and C. aminophilum higher numbers were found after 24 and 48 hours as compared to the inoculum. The adaption in the Rusitec had not yet been fully completed after 48 hours, since for several species a different abundance was found on day 13 of incubation (Period 2). The provision of fresh substrate at the beginning of Period 2 led to an increase of almost all species and groups within the following two to four hours, with the exception of the protozoa and methanogens. The reduction of the protozoal population and methanogens could have been the result of migration from fermenter liquids to new feed particles and also the fact that some species of methanogens are associated to protozoa. Likewise, sampling of the feed residues after 24 and 48 hours was too late since the microorganisms could have been already detached. However, sampling of the feed residues at shorter intervals is not possible in the Rusitec. No effect of silage was observed on the abundance of total bacteria, methanogens and Selenomonas ruminantium. Methanogens and S. ruminantium do not use the substrate itself but rather fermentation end products of other ruminal microorganisms. Although no effect of silage was observed on the abundance of methanogens, more methane was produced during the incubation of grass silage than corn silage. This is in accordance with results described in literature that an abundance of methanogens is not associated with the production of methane. The corn silage promoted the abundance of protozoa and Ruminobacter aminophilus whereby the latter could only be detected during the first 48 hours of incubation. Quantification was not possible because of the generation of unspecific products during real-time qPCR. Fibrobacter succinogenes was also promoted by corn silage even though this is one of the most active cellulolytic species in the rumen. It could be possible that this species had an advantage in the degradation of the cell wall structures of C4 plants (which corn accounts to) as compared to other cellulolytic species. The grass silage promotes the abundance of the cellulolytic Ruminococcus albus as well as P. bryantii and C. aminophilum. The last two species use amino acids and proteins as energy sources thereby the latter belongs to hyper ammonia producing bacteria which could be the reason for the higher ammonia concentration in fermenter liquids during the incubation of grass silage compared to corn silage. In the second study (Manuscript 2), the effects of supplementing corn silage with different nitrogen sources on ruminal microbial community composition and ruminal microbial crude protein synthesis was investigated. Higher efficiency of microbial crude protein synthesis with corn silage has been reported from in vivo studies, while in vitro contradictory results were found. It was proposed that the different nitrogen content of the silages, and especially the lack of rumino-hepatic circulation in vitro, could be the reason for the lower efficiency of microbial crude protein synthesis when using corn silage. Different microbial species prefer different nitrogen sources as already observed in pure cultures and partially also in mixed cultures. Thus, in the second study, corn silage was supplemented with urea, pea protein, pea peptone or mixed free amino acids. With the supplementation of peptone and urea to corn silage, the highest efficiency of microbial crude protein synthesis was observed followed by amino acids and protein supplementation. But none of the used nitrogen sources allowed corn silage to achieve the level of microbial crude protein synthesis observed for grass silage. The protozoal population was negatively correlated with the efficiency of microbial crude protein synthesis which could have been a result of the higher energy requirement of protozoa compared to bacteria. Furthermore, protozoa engulfs and ingests bacteria and uses it as the main energy and protein source which could also have a negative effect on the efficiency of microbial crude protein synthesis. The effects of different nitrogen sources on the abundance of microbial groups and species not always were in accordance with reports in the literature. This could be attributed to the use of different substrate and pure cultures. In the third study (Manuscript 3), the effect of grass silage and corn silage on the ruminal microbial community composition in vivo was investigated. Three lactating Jersey cows fitted with a permanent cannula were fed with rations based on grass silage or corn silage. The rations contained the same amount of concentrate. In order to adjust the nitrogen content of the rations the corn silage based ration was supplemented with urea. The corn silage based ration promoted the abundance of total bacteria in the solid fraction obtained from the rumen, as well as the protozoal population in the solid and liquid fraction. It could be possible that the higher content of readily fermentable carbohydrates, mainly starch, of the corn silage in combination with the urea could have had a positive effect on both groups. Furthermore, a higher abundance of F. succinogenes was observed in animals fed with the corn silage-based ration. As expected, the cellulolytic bacteria R. albus and R. flavefaciens were enhanced by the grass silage-based ration as well as P. bryantii and R. amylophilus. The latter are known to use starch and maltose as energy source and to use their proteolytic activity only to achieve access to protein-coated starch. It is assumed that the combination of grass silage and concentrate could have had an influence on this species. For S. ruminantium, a feeding effect on the abundance was only observed in the liquid fraction while in the solid fraction no effect was found. There was also no observable effect of ration on the abundance of C. aminophilum, RCC and the methanogens. Changes of the ruminal microbial community over time were observed. But no consistent increase of all species and groups after the phase with the highest dry matter intake of fresh feed became obvious. In conclusion, the results of the current thesis showed that grass and corn silages differently affected the composition of the ruminal microbial community in the liquid and solid fractions of the rumen content. Furthermore, significant diurnal changes of the ruminal microbial community could be observed in vitro as well as in vivo. These results highlighted the need of repeated sampling during the day and suggest the consideration of both ruminal compartments, liquid and solid.
Kurzfassung auf Deutsch:		In Deutschland und Europa zählen Gras- und Maissilage zu den am häufigsten eingesetzten Silagen in der Fütterung von Milchkühen und Mastrindern. Aufgrund deren unterschiedlicher chemischer Zusammensetzung zeigen sich unterschiedliche Auswirkungen auf die Mikroorganismengemeinschaft und somit den Fermentierungsprozess im Pansen. Hauptziel dieser Arbeit war es daher, den Einfluss der unterschiedlichen Silagen auf die ruminale mikrobielle Gemeinschaft zu untersuchen. Der Schwerpunkt lag dabei auf der Beurteilung des alleinigen Effekts der Silagen, ohne Zulage von Kraftfutter. Zusätzlich wurde die zeitliche Veränderung der Mikroorganismengemeinschaft untersucht. In der ersten Studie (Manuskript 1) wurden der Effekt der alleinigen Inkubation von Gras- und Maissilage auf die ruminale mikrobielle Gemeinschaft im Rusitec untersucht, sowie die zeitliche Veränderung und die Adaptionsphase während der ersten 48 h. Dabei konnte eine deutliche Verringerung der gesamten mikrobiellen Gemeinschaft in der Fermenterflüssigkeit, sowohl auf Spezies- als auch auf Gruppenebene beobachtet werden. Die Silagen spielten in dieser Zeit nur eine untergeordnete Rolle, da kein Unterschied zwischen den Blindwert-Fermentern und den Silage-Fermentern festgestellt wurde. Eine Ausnahme war für Clostridium aminophilum zu beobachten, für den nach 48 h eine höhere Konzentration als im Inokulum nachgewiesen wurde. Wie bereits in der Literatur beschrieben, konnten auch in dieser Studie insgesamt geringere Konzentrationsveränderungen in den Beutelrückständen im Vergleich zur Fermenterflüssigkeit beobachtet werden. So zeigten die Protozoen in den Beutelrückständen während der Adaptionsphase eine deutliche Reduktion, währenddessen für Prevotella bryantii und C. aminophilum eine deutlich höhere Anzahl nach 24 h und 48 h zu beobachten war. Nach 48 h schien die Adaptionsphase noch nicht vollständig abgeschlossen zu sein, da zu Beginn der 2. Periode (Tag 13) für einige Spezies unterschiedliche Konzentrationen nachweisbar waren. Nach der Inkubation von frischem Substrat (in Periode 2) war ein deutlicher Anstieg der Abundanz aller untersuchten Spezies und Gruppen, mit Ausnahme der Protozoen und Methanogenen, innerhalb der ersten zwei bis vier Stunden in der Fermenterflüssigkeit beobachtbar. Die Reduktion der Protozoen und Methanogenen ist wohl auf eine aktive Abwanderung der Protozoen aus der Fermenterflüssigkeit hin zum neuen Substrat zurückzuführen und die Assoziation einiger Methanogenen an die Protozoen. Es ist anzunehmen, dass die Untersuchung der Beutelrückstände nach 24 h und 48 h suboptimal ist, da sich zu diesem Zeitpunkt die Mikroorganismen bereits wieder abgelöst haben könnten. So konnten kaum Veränderungen der partikel-assoziierten Mikroorganismen nachgewiesen werden. Allerdings ist eine Probenahme aus den Beutelrückständen in einem kürzeren Zeitintervall im Rusitec nicht umsetzbar. Es konnte kein Effekt der Silagen auf die Gesamtbakterien, sowie die Methanogenen und S. ruminantium, beobachtet werden. Die Methanogenen, als auch S. ruminantium, nuzen nicht direkt das Substrat, sondern Fermentationszwischen- und endprodukte anderer Mikroorganismen. Obwohl keine Veränderung in der Anzahl der Methanogenen zu beobachten war, wurde während der Inkubation von Grassilage mehr Methan gebildet. Dies deckt sich mit Ergebnissen aus der Literatur, in denen kein Zusammenhang zwischen der Anzahl der Methanogenen und der Methanbildung festgestellt werden konnte. Die Maissilage förderte die Protozoen und R. amylophilus, wobei letzterer nur in den ersten 48 h quantifiziert werden konnte. Anschließend bildeten sich während der real-time qPCR unspezifischen Produkte, die eine eindeutige Quantifizierung nicht zuließen. Ebenso war die Anzahl von F. succinogenes, einer der aktivsten Zellulolyten, bei der Inkubation von Maissilage höher. Es ist anzunehmen, dass diese Spezies im Vergleich zu anderen zelluloytischen Spezies einen Vorteil beim Abbau von Zellwänden von C4-Pflanzen, zu denen die Maispflanzen gehören, hat. Die Grassilage förderte den Zellulolyten, Ruminococcus albus sowie P. bryantii und C. aminophilum. Die beiden letzt genannten nutzen Aminosäuren und Peptide als Energiequelle, wobei letzterer zu den hyper ammonia producing bacteria (HAB) zählt. Dies könnte der Grund für die höhere Ammoniakkonzentration in der Fermenterflüssigkeit während der Inkubation von Grassilage sein. Aufgrund von vorangegangenen Studien wurde in der zweiten Studie (Manuskript 2) der Effekt von unterschiedlichen Stickstoffquellen auf die Mikroorganismen und die Effizienz der mikrobiellen Proteinsynthese untersucht. In vivo konnte im Vergleich zur Maissilage bei der Verfütterung von Grassilage eine höhere Effizienz der mikrobiellen Proteinsynthese beobachtet werden. In vitro wurden hingegen gegenläufige Ergebnisse gefunden. Nach ersten Recherchen war davon ausgegangen worden, dass der unterschiedliche Stickstoffgehalt der Silagen und vor allem der fehlende ruminohepatische Kreislauf in vitro, Grund für die verminderte Effizienz der mikrobiellen Proteinsynthese war. Allerdings konnte nach Zulage von Harnstoff zur Maissilage kein zufriedenstellendes Ergebnis erzielt werden. Wie bereits in Reinkulturen und zum Teil in Mischinkubationen nachgewiesen, bevorzugen unterschiedliche Spezies unterschiedliche Stickstoffquellen. Somit wurde in der zweiten Studie Maissilage entweder mit Harnstoff, Erbsenprotein, Erbsenpepton oder einer Mischung aus freien Aminosäuren ergänzt. Durch die Zulage von Pepton und Harnstoff konnte innerhalb der Stickstoffzulagen die höchste Effizienz der mikrobiellen Proteinsynthese erzielt werden. Gefolgt von den Aminosäuren und dem Protein. Allerdings konnte keine Variante das Niveau der Grassilage erreichen. Die Protozoen waren negativ mit der Effizienz der mikrobiellen Proteinsynthese korreliert, was auf den erhöhten Energiebedarf der Protozoen zurückgeführt werden könnte. Außerdem nutzen Protozoen Bakterien als Energie- und Proteinquelle, was ebenfalls einen negativen Effekt auf die Effizienz der mikrobiellen Proteinsynthese haben dürfte. Die Effekte der Stickstoffzulage auf die Abundanz einzelner Spezies und Gruppen stimmten nicht immer mit Berichten in der Literatur überein. Dies kann zum Teil auf die Verwendung von Reinkulturen und unterschiedlichen Substraten zurückgeführt werden. In der dritten Studie (Manuskript 3) wurde der Effekt von Mais- und Grassilage auf die ruminale mikrobielle Gemeinschaft in vivo untersucht. Dazu wurde drei Jersey-Rindern entweder eine Grassilage oder Maissilage basierte Ration mit dem gleichen Anteil Kraftfutter verfüttert. Zum Ausgleich des höheren Stickstoffgehaltes der Grassilage wurde der Maissilage Harnstoff hinzugefügt. Die Maissilage basierte Ration förderte die Gesamtbakterienzahl in der festen Phase, sowie die Protozoen in beiden Phasen. Es könnte möglich sein, dass der höhere Gehalt an leicht verdaulichen Kohlenhydraten, die in der Maissilage vermehrt vorkommen, in Kombination mit dem Stickstoff aus der Harnstoffzulage diese beiden Gruppen förderte. Ebenfalls war wieder eine höhere Abundanz von F. succinogenes in der festen Phase bei der Fütterung der Maissilage-basierten Ration zu beobachten. Wie erwartet, wurden die Zellulolyten R. albus und Ruminococcus flavefaciens durch die Fütterung der Grassilage-basierten Ration gefördert. Ebenso wie P. bryantii und R. amylophilus, wobei letzterer Stärke und Maltose als Energiequelle nutzt und seine proteolytische Aktivität nur benötigt, um Proteinummantelte Stärkekörner freizulegen. Es ist anzunehmen, dass die Kombination aus Grassilage und Kraftfutter einen positiven Einfluss auf diese Spezies hatte. S. ruminantium war nur in der flüssigen Phase durch die Fütterung der Grassilage basierten Ration gefördert worden, während in der festen Phase kein Effekt der Ration nachgewiesen werden konnte. Ebenso konnte kein Effekt der Ration auf C. aminophilum, Rumen Cluster C (RCC) und die Methanogene beobachtet werden. Wie bereits in vitro, konnte auch in vivo eine deutliche Veränderung der mikrobiellen Gemeinschaft über die Zeit nachgewiesen werden. Allerdings war kein einheitlicher Anstieg aller Spezies, nach der Aufnahme einer größeren Menge Futters, wie in vitro der Fall war, zu beobachten gewesen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass unterschiedliche Silagen zu einer Veränderung in der Zusammensetzung der ruminalen mikrobiellen Gemeinschaft führen. Desweitern konnte eine deutliche Veränderung der mikrobiellen Gemeinschaft innerhalb eines Tages nachgewiesen werden. Dies unterstreicht die Notwendigkeit, einer wiederholten Probenahme, um eine repräsentative Aussage über den Effekt auf die mikrobielle Gemeinschaft treffen zu können

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