Functional and structural studies of a C-terminally extended YidC

Seitl, Ines

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Seitl, Ines

Functional and structural studies of a C-terminally extended YidC

Funktionelle und strukturelle Untersuchungen eines C-terminal verlängerten YidCs

(Übersetzungstitel)

Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:100-opus-11913
URL: http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2016/1191/

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SWD-Schlagwörter:

Escherichia coli , Proteintransport , Signalerkennungspartikel , Rhodopirellula baltica , Ribosom

Freie Schlagwörter (Deutsch):

YidC Insertase , MscL Protein , Membraninsertion , Cryo-EM , Microscale Thermophorese

Freie Schlagwörter (Englisch):

membrane insertion , ribosome , SRP targeting , YidC insertase , Cryo-EM reconstruction

Institut:

Institut für Mikrobiologie

Fakultät:

Fakultät Naturwissenschaften

DDC-Sachgruppe:

Biowissenschaften, Biologie

Dokumentart:

Dissertation

Hauptberichter:

Kuhn, Andreas Prof. Dr. rer. nat.

Sprache:

Englisch

Tag der mündlichen Prüfung:

18.02.2016

Erstellungsjahr:

2015

Publikationsdatum:

11.04.2016

Lizenz:

Dieser Inhalt ist unter einer Creative Commons-Lizenz lizenziert.

Kurzfassung auf Englisch:

Members of the YidC/Oxa1/Alb3 protein family catalyze the insertion of integral membrane proteins into the lipid bilayer of the bacterial plasma membrane (YidC), the inner mitochondrial membrane (Oxa1), and the chloroplast thylakoid membrane (Alb3) (Saller et al., 2012; Dalbey et al., 2014). The insertase homologs are comprised of a conserved core region of 5 transmembrane domains, but are provided with additionally flanking N- and C-terminal regions of variable lengths and functions. The Gram-negative YidC is characterized by an additional N-terminal domain, while Gram-positive bacteria, mitochondria and plastids developed C-terminally extended insertase-domains. These domains are involved e.g. in direct interaction with ribosomes and facilitate a functional overlap with the co-translational SRP-targeting pathway. An extended C-terminal highly positively charged tail region was also found in the YidC homologs of the Gram-negative marine bacteria Rhodopirellula baltica and Oceanicaulis alexandrii, but not in Escherichia coli.
The primary subject of this work was to characterize and analyze in detail the C-terminally extended YidC chimera, composed of the E. coli YidC and the C-terminally extended domains of the marine YidC homologs. Biochemical binding assays with the purified YidC proteins and isolated, vacant E. coli 70S ribosomes showed that the C-tails mediate specific binding to ribosomes independently of the translational state of the ribosome. Furthermore, a ribosome-bound insertase complex was visualized by cryo-electron microscopy. The enhanced affinity of the C-terminally extended YidC was used to isolate stable complexes with stalled ribosomes, carrying a nascent polypeptide chain of a YidC substrate protein (MscL). The cryo-EM structure of a YidC-ribosome nascent chain complex (RNC) was solved to a 8,6 Å resolution and allowed the visualization of the nascent chain from the peptidyl transferase center through the ribosomal exit tunnel into the YidC density. The structure revealed the helix H59 of the 23S rRNA and the two ribosomal proteins L24 and L29 as the major contacts sites of YidC at the ribosomal tunnel exit. Pull down assays confirmed a significantly interaction of the C-terminal ribosome binding domain and the ribosomal protein L29, while L24 seems to be a universal contact site for the YidC-insertase core domain. Strikingly, the cryo-EM structure clearly showed a single monomer of YidC bound to the translating ribosome. This suggests that monomeric YidC might be the minimal functional unit for YidC-dependent, co-translational insertion of inner membrane proteins.
In addition to the in vitro tests, a possible role of the C-terminal YidC extensions in co-translational protein targeting was tested in vivo in E. coli. For that purpose the targeting and localization of the SRP-dependent YidC-substrate protein MscL (Facey et al., 2007) was investigated as a GFP fusion protein via fluorescence microscopy. In addition, the proper membrane insertion of MscL was analyzed in radioactive pulse chase experiments via AMS gel shift assays, either in the absence of a functional SRP or SRP receptor (FtsY). Both in vivo assays clearly showed that the C-terminal ribosome binding domain of the R. baltica YidC homolog can partially substitute for the SRP receptor function in E. coli, while the cytosolic signal recognition particle is still required for correct insertion of the MscL protein. Therefore, a new co-translational targeting and insertion model of YidC-only substrates was proposed. This works also highlights evolutionary aspects of the accessory YidC domains and indicates that the C-terminal extended tail of YidC in the planctomycete group may be an ancestral remnant of a primordial translocation system operating without a typical SRP receptor.
The second part focuses on the interaction of the signal recognition particle with SRP signal sequences. Isolated mutant signal sequence peptides were used to determine the specificity of SRP recognition in proteins. The interaction studies were established in an in vitro system and binding affinities of purified SRP to the isolated signal sequence peptides were determined via microscale thermophoresis (MST). A short sequence of 27 amino acid residues at the very N-terminal tail of the large cytoplasmic domain of KdpD was identified as a SRP signal sequence. Furthermore, a direct influence of the amino acid composition in the signal peptide on its SRP binding affinity in vitro was demonstrated. This confirms a low influence of an altered charge in the N-terminal region while mutations in the hydrophobic core region causes significantly reduced binding affinities to SRP. Taken together, this study contributes to the understanding of the molecular mechanisms of co-translational membrane protein biogenesis in bacteria.

Kurzfassung auf Deutsch:

Proteine aus der YidC/Oxa1/Alb3-Famile vermitteln die direkte Insertion von integralen Membranproteinen in den Lipid-Bilayer der bakteriellen Plasmamembran (YidC), in die innere Mitochondrien-Matrix (Oxa1) und in die Thylakoidmembran von Chloroplasten (Alb3) (Saller et al., 2012; Dalbey et al., 2014). Die Homologe dieser Insertase-Familie besitzen eine konservierte Kernregion aus 5 Transmembrandomänen und zusätzliche N- und C-terminale Regionen, die sich in ihrer Länge und Funktion stark voneinander unterscheiden. Charakteristisch für das YidC aus Gram-negativen Bakterien ist eine zusätzliche N-terminale Transmembrandomäne, während Mitochondrien und Plastide C-terminal verlängerte, hydrophile Domänen an ihren Insertasen besitzen. Diese C-terminalen Domänen sind zum Beispiel an der direkten Bindung von Ribosomen beteiligt und verleihen der Insertase co-translationale Funktionen die sich mit dem SRP-Targetingmechanismus überschneiden. Im Gegensatz zur YidC-Insertase aus E. coli, besitzen die Gram-negativen, marinen Bakterien Rhodopirellula baltica und Oceanicaulis alexandrii YidC Homologe mit C-terminal erweiterten, positiv geladenen, hydrophilen Domänen.
Ziel dieser Arbeit war die detaillierte Charakterisierung und Analyse von C-terminal erweiterten YidC-Chimären. Die YidC-Chimären bestehen aus Fusionen des E. coli YidC Proteins und den C-terminalen Domänen der marinen YidC Homologe. Biochemische Bindungsstudien mit den gereinigten YidC-Proteinen und isolierten E. coli 70S Ribosomen zeigten, dass die C-terminalen Domänen eine spezifische Bindung an die Ribosomen vermitteln. Ähnlich zu der essentiellen Funktion der C-terminalen Domäne von Oxa1 war die Ribosomenbindung der YidC-Chimären unabhängig von einer translatierten Polypeptidkette am Ribosom. Des Weiteren, wurde ein Komplex aus naszierendem Ribosom (RNC) und gebundener YidC-Chimäre mittels Kryo-Elektronenmikroskopie auf 8,6 Å gelöst. In der Struktur konnte man den Weg der wachsenden Polypeptidkette vom Peptidyltransferase-Zentrum, durch den Ausgangstunnel des Ribosoms bis hinein in das YidC Protein verfolgen. Mit Hilfe der Kryo-EM Struktur wurde die Helix H59 der 23S rRNA und die beiden ribosomalen Proteine L24 und L29 als Hauptkontakte des YidCs am Ribosom identifiziert. Durch Pull-Down Versuche konnte eine signifikante Interaktion der C-terminalen Domäne mit L29 gezeigt werden, wohingegen L24 vermutlich eine Interaktion mit der YidC-Kerndomäne eingeht. Außerdem lieferte die Struktur des YidC:RNC Komplexes den Beweis, dass ein einzelnes YidC-Molekül an translatierende Ribosomen bindet und somit vermutlich die minimalste, funktionelle Einheit für die YidC-abhängige, co-translationale Insertion von Membranproteinen darstellt.
Um die in vivo-Funktion der C-terminalen YidC Domänen während des co-translationalen Targetings in E. coli zu untersuchen, wurde das Membrantargeting des SRP-abhängigen YidC-Substratproteins MscL (Facey et al., 2007) als GFP-Fusionsprotein mittels Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Parallel dazu wurde die korrekte Membraninsertion von MscL über eine AMS-Modifizierung in radioaktiven pulse-chase Experimenten analysiert. Beide in vivo Untersuchungen zeigten, dass die C-terminale Ribosomenbindedomäne des R. baltica YidC Homologs zu einem gewissen Teil die Funktion des SRP-Rezeptors in E. coli übernehmen kann. Dabei wird jedoch SRP weiterhin für die korrekte Insertion von MscL benötigt. In dieser Arbeit werden ebenfalls evolutionäre Aspekte der akzessorischen YidC-Domänen behandelt, die darauf schließen lassen, dass die C-terminale YidC-Domäne in der Gruppe der Planktomyceten eine Art Überbleibsel eines Vorfahren mit primitivem Translokationssystem ohne klassischem SRP-Rezeptor ist.
Der zweite Teil dieser Arbeit behandelt die Interaktion des Signal-Erkennungs-Partikel (SRP) mit SRP-Signalsequenzen. Um die Spezifität der SRP-Erkennung von Proteinen zu bestimmen wurden isolierte Peptide mit verschiedenen Signalsequenzmutationen verwendet. Die Bindungsaffinitäten der in vitro Interaktionsstudien von SRP und den Signalsequenz-peptiden wurden mittels Microscale Thermophorese (MST) bestimmt. Eine Sequenz von 27 Aminosäureresten am Anfang der großen N-terminalen, cytoplasmatischen Domäne des KdpD Proteins wurde als SRP-Signalsequenz identifiziert. Darüber hinaus konnte ein direkter Einfluss der Aminosäurekomposition im Signalpeptid auf die Bindungsaffinität zu SRP in vitro gezeigt werden. Während die Ladungsänderung in der N-terminalen Region des Signalpeptids nur einen geringen Einfluss auf die Interaktion mit SRP hatte, zeigten Mutationen in der hydrophoben Kernregion des Peptids eine deutlich verringerte Bindeaffinität zu SRP. Beide Teilaspekte dieser Arbeit tragen zum Verständnis des molekularen Mechanismus der co-translationalen Biogenese von integralen Membran-proteinen in Bakterien bei.