TY  - THES
T1  - Herstellung monoklonaler Antikörper gegen thermostabile Antigene von Bacillus anthracis zur Anwendung in der Anthraxdiagnostik
A1  - Hilss,Karen
Y1  - 2013/05/10
N2  - Bei dem Ascoli Präzipitin Test (ASCOLI, 1911) handelt es sich um eine schnelle und kostengünstige Diagnostikmethode, bei der polyklonales Serum gegen thermostabile Antigene von B. anthracis eingesetzt wird. Allerdings ist dieser Test ungeeignet für Umweltproben, da Kreuzreaktionen mit anderen Bacillus Spezies auftreten. Durch die Verwendung monoklonaler Antikörper gegen spezifische thermostabile Antigene von B. anthracis könnte jedoch die Kreuzreaktivität mit anderen Bacillus Spezies eliminiert werden. In dieser Arbeit wurden monoklonale Antikörper gegen potentiell B. anthracis spezifische thermostabile Antigene hergestellt, die bei den getesteten Bacillus ssp. (nicht-anthracis) keine Kreuzreaktionen aufwiesen. Zu Beginn wurden thermostabile Antigenpräparationen von vegetativen B. anthracis und Bacillus ssp. (nicht-anthracis) Kulturen, sowie Präparationen von B. anthracis und B. cereus Sporen hergestellt. Die insgesamt acht thermostabilen Antigenpräparationen wurden zur Immunisierung von Kaninchen verwendet und die gewonnenen polyklonalen Antiseren wurden im Western Blot auf Kreuzreaktionen zwischen B. anthracis und Bacillus ssp. (nicht-anthracis) untersucht. Nach Abschluss dieser Kreuzreaktivitätsversuche wurden zwei Proteine mit einem ungefähren Molekulargewicht von 30 bzw. 50 kDa identifiziert, welche spezifisch in Antigenpräparationen von B. anthracis vorhanden sind und nicht mit Seren von Kaninchen, die mit Bacillus ssp. Antigenpräparationen immunisiert worden waren, reagierten. Das 30 kDa große Protein ist in vegetativen Antigenpräparationen von B. anthracis, wie auch in B. anthracis Sporenpräparationen vorhanden, während das 50 kDa große Protein nur in vegetativen Antigenpräparationen von B. anthracis vorhanden ist. Diese potentiell B. anthracis spezifischen Proteine wurden aus der vegetativen B. anthracis thermostabilen Antigenpräparation durch Anionenaustausch-chromatographie mittels FPLC fraktioniert und zur Immunisierung von BALB/c Mäusen verwendet. Die Milzzellen der Maus mit der höchsten spezifischen Antikörperbildung wurden mit Myelomzellen fusioniert und die dabei entstandenen Hybridomzellen in Kultur genommen. Im Screening mittels ELISA wurden die Klone auf die Produktion  spezifischer Antikörper gegen die 30 bzw. 50 kDa großen potentiell B. anthracis spezifischen thermostabilen Antigene getestet. Nach 14 Screenings erfolgte eine Trennung der positiven Klone in zwei Linien mit unterschiedlichen Auswahlkriterien. Die Klone der V- (vegetativ) Linie wurden auf spezifische Antikörper gegen vegetative B. anthracis Präparationen getestet, die Klone der S- (Sporen) Linie auf spezifische Antikörper gegen B. anthracis Sporenpräparationen. Nach zwei bzw. vier Screenings in der V-Linie konnten die drei monoklonalen Zelllinien BaV5, BaV15 und BaV16 etabliert werden. Die Bestimmung der Immunglobulinklasse ergab, dass es sich bei der Zelllinie BaV5 um eine Mischkultur mit mehreren unterschiedlichen Antikörpern handelte, bei den von den Zelllinien Bav15 und BaV16 produzierten Antikörper handelte es sich um Immunglobuline der Klasse M. Bei der Bestimmung der Spezifität der von der Firma Squarix Biotechnology gereinigten monoklonalen Antikörper BaV15 und BaV16 konnten im ELISA keine Kreuzreaktionen mit den getesteten Antigenpräparationen von vegetativen Zellen und Sporen verschiedener Bacillus ssp. (nicht-anthracis) festgestellt werden. Allerdings erwiesen sich die gereinigten monoklonalen Antikörper der Klasse M als instabil. Versuche die Antikörper durch Zusätze zu stabilisieren, führten zu keinem Erfolg, so dass weiterführende Analysen zur Charakterisierung der monoklonalen Antikörper BaV15 und BaV16 nicht möglich waren.
KW  - Bacillus anthracis
KW  - Monoklonaler Antikörper
KW  - Diagnostik
KW  - Milzbrand
CY  - Hohenheim
PB  - Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
AD  - Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart
UR  - http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2013/844
ER  -