TY  - THES
T1  - Charakterisierung der lichtinduzierten Internalisierung des Ionenkanals TRPL aus Drosophila melanogaster
A1  - Oberegelsbacher,Claudia
Y1  - 2013/03/14
N2  - Die lichtinduzierte Isomerisierung von Rhodopsin in den Komplexaugen von Drosophila führt zur Aktivierung der visuellen Signalkaskade. Der daraus resultierende Kationen-Einstrom durch die beiden Kanäle TRP und TRPL führt letztlich zur Ausbildung eines depolarisierenden Rezeptorpotentials. Darüber hinaus induziert der lichtabhängige Ca2+- Einstrom eine Änderung der subzellulären Lokalisation des TRPL-Kanals. In dunkeladaptierten Fliegen befindet sich der TRPL-Kanal innerhalb der Rhabdomere, während er in helladaptierten Fliegen in einem unbekannten Speicherkompartiment im Zellkörper der Photorezeptorzelle lokalisiert ist. Die lichtabhängige Translokation des TRPL-Kanals ist reversibel. Der Mechanismus dieses lichtinduzierten Transports ist noch weitestgehend ungeklärt, allerdings legen Beobachtungen von vesikulären Strukturen auf immunzytochemischen Schnitten belichteter Fliegen eine Vesikel-vermittelte Endozytose nahe.
In der vorliegenden Arbeit wurde der Mechanismus der lichtinduzierten Internalisierung des TRPL-Kanals charakterisiert. Anhand immunzytochemischer Studien wurde gezeigt, dass die bei Belichtung gebildeten vesikulären Strukturen nicht nur TRPL sondern darüber hinaus auch Rhodopsin (Rh1) enthalten. Rhodopsin wird wie viele G-Protein-gekoppelte Rezeptoren nach Aktivierung internalisiert. Da bei verschiedenen Wellenlängen unterschiedliche Mengen an aktiviertem Rhodopsin (Metarhodopsin) gebildet werden, hängt die Endozytoserate von Rhodopsin maßgeblich von der Wellenlänge des verwendeten Lichts ab. Um die Endozytoserate von Rh1 aber auch von TRPL quantitativ zu erfassen, wurde die Anzahl der gebildeten Vesikel bei verschiedenen Lichtqualitäten bestimmt. Dabei zeigte sich, dass TRPL bei einer hohen Rh1-Endozytoserate (induziert durch Blaulicht) kaum internalisiert wird, wohingegen Orangebelichtung zu einer starken TRPL-Endozytoserate bei geringer Rh1-Internalisierung führt. Die unterschiedlichen Endozytoseraten von TRPL bei verschiedenen Lichtqualitäten spiegelten sich auch in der Kinetik der TRPL-Translokation wider, was durch die Quantifizierung von Zeitverläufen belegt werden konnte. Diese Ergebnisse legen eine Kompetition zwischen Rh1 und TRPL bezüglich ihrer Internalisierung nahe, deren Ursache in einer Konkurrenz um einen gemeinsamen Internalisierungsfaktor begründet sein könnte.
Durch Analyse der Endozytose in verschiedenen Mutanten konnte überdies gezeigt werden, dass die Endozytose von TRPL zwingend der Aktivierung der Signalkaskade bzw. des damit einhergehenden Ca2+-Einstroms bedarf, während die Internalisierung von Rhodopsin auch in Abwesenheit von Ca2+ erfolgt. Die Internalisierung von Rh1 und TRPL scheint folglich durch unterschiedliche Mechanismen aktiviert zu werden.
Allerdings stellte sich heraus, dass die letztendliche Abschnürung von TRPL-enthaltenden endozytotischen Vesikeln, analog zur Internalisierung von Rh1, ein Dynamin-abhängiger Prozess ist. 
Die Endozytose von Rh1 wird durch das monomere G-Protein Rab5 vermittelt. Durch einen Screen 
dominant-negativer Rab-Mutanten konnte gezeigt werden, dass die lichtinduzierte Endozytose von TRPL durch die beiden Proteine Rab5 und RabX4 vermittelt wird. Somit stellt die Beteiligung von Rab5 an der Internalisierung beider Proteine eine weitere Gemeinsamkeit dar.
Arrestine spielen bei der Endozytose von Rh1 eine wichtige Rolle. Während Arrestin2 die Inaktivierung des Metarhodopsins vermittelt, leitet Arrestin1 anschließend dessen Internalisierung ein. Dies gilt jedoch nicht für die Internalisierung des TRPL-Kanals. Arrestin2 besitzt im Fall von TRPL jedoch eine wichtige Funktion in Bezug auf dessen Stabilität im Rhabdomer. In der vorliegenden Arbeit wurde durch Analyse verschiedener arr2-Allele belegt, dass der TRPL-Kanal im Dunkeln innerhalb von 10 Tagen vollständig abgebaut wird, während er im Licht stabil bleibt. Folglich vermittelt Arr2 möglicherweise die Verankerung von TRPL im Rhabdomer in Dunkelheit, wohingegen es keine Bedeutung für die Stabilität des im Zellkörper lokalisierten TRPLs besitzt.
Die Internalisierung von Rh1 und TRPL unterscheidet sich auch im Schicksal des internalisierten Proteins. Während endozytiertes Rhodopsin letztendlich einem lysosomalen Abbau unterliegt, wird im Fall des TRPL-Kanals von einem Recylingprozess ausgegangen. 
In dieser Arbeit gelang es, Kolokalisationen zwischen TRPL und einem Marker für Recyclingendosomen in helladaptierten Fliegen nachzuweisen, was eine Beteiligung dieser Kompartimente am TRPL-Transport nahelegt. Unter Verwendung eines Lysosomenmarkers gelang es überdies zu demonstrieren, dass internalisiertes TRPL, im Gegensatz zu Rhodopsin1, nicht mit Lysosomen kolokalisiert, was die Existenz eines Recylingprozesses unterstreicht.

KW  - Ionenkanal
KW  - Drosophila
KW  - Vesikel
KW  - Translokation
KW  - Endocytose
CY  - Hohenheim
PB  - Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
AD  - Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart
UR  - http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2013/826
ER  -