RT Dissertation/Thesis
T1 Interaktion des Portalring-Proteins gp20 des Bakteriophagen T4 mit Wirtsproteinen von Escherichia coli
A1 Quinten,Tobias
WP 2012/12/17
AB Der Bakteriophage T4 setzt sich aus den drei strukturellen Untereinheiten Kapsid, Schwanz und Schwanzfibern zusammen und gehört aufgrund seiner kontrahierbaren Schwanzhülle zu den komplexen Myoviridae. Eine Besonderheit im Phagenreich stellt die Membran-assoziierte Kapsidmorphogenese während einer T4-Infektion von E. coli dar. Hierbei bildet sich ausgehend von den beiden Proteinen gp20, dem Portalring-Protein des Phagen T4, und dem Phagen-eigenen Chaperon gp40 ein Membran-gebundener Komplex. Eine Beteiligung bakterieller Proteine wurde vermutet. Dieser Komplex dient als Startpunkt für die weitere Kapsidmorphogenese, die durch die Bildung einer Kern- und Gerüststruktur zu reifen Kapsiden führt, die anschließend im Cytoplasma mit DNA gefüllt werden.
Im Rahmen dieser Dissertation wurde die Rolle und Funktion des Portalring-Proteins gp20 sowie seine Interaktionen mit zellulären Proteinen genauer analysiert. Hierzu wurde gp20 mit einem His-Tag versehen, wodurch eine Protein-Reinigung mittels Nickel-Affinitätschromatographie möglich war. Durch die nachfolgende Quervernetzung mit Formaldehyd wurden Wechselwirkungen zwischen His-gp20 und den zellulären Chaperonen DnaK, GroEL, Tig und YidC sowie dem Phagen-eigenen Chaperon gp40 nachgewiesen. Lokalisationsstudien mit gp20-GFP sowie mit wildtypischem gp20 bestätigten den Einfluss von YidC und DnaK auf die Membran-Assoziation des Portalring-Proteins. Die Phagenvermehrung wurde durch YidC-Depletion  nicht beeinflusst, wohingegen der Verlust von DnaK zu einer verminderten Vermehrung führte. Vorkopf-Strukturen, die eine Zwischenstufe der vollständigen Kapsidmorphogenese darstellen, konnten mit Hilfe einer Phagenmutante in YidC-freien E. coli-Zellen nicht-membrangebunden isoliert werden.
Frühere Studien hatten zur Isolierung verschiedener Ambermutanten geführt. Die Mutante Amber20E481 wurde in der vorliegenden Arbeit verwendet, um die Kapsidmorphogenese genauer zu untersuchen. Es zeigte sich, dass es bei einer nicht-permissiven Infektion zur Synthese einer um 14 Aminosäuren verkürzten gp20-Variante kommt. Obwohl sich das entsprechende Protein, gp20s, in Lokalisations- und Expressionsstudien wie wildtypisches gp20 verhält, ist die Kapsidmorphogenese blockiert. Die überexprimierte und mit einem His-Tag versehene Variante His-gp20s konnte wie das wildtypische gp20 mit YidC, GroEL und gp40 quervernetzt werden. Strukturelle Analysen am Transmissionselektronenmikroskop ergaben, dass die reifen Vorköpfe nicht mit Phagen-DNA gefüllt waren. Wahrscheinlich ist hierfür eine Fehlfunktion bei der DNA-Verpackung verantwortlich. 

K1 T-Phagen
K1 Infektion
K1  Virionmorphogenese
K1 Vorkopf
K1 gp20
PP Hohenheim
PB Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
UL http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2012/788