TY - THES T1 - Membraneinbau von MscL und MscL-Mutanten aus Escherichia coli A1 - Neugebauer,Stella Y1 - 2012/12/17 N2 - Etwa ein Drittel aller in der Zelle synthetisierten Proteine sind Membranproteine. Um ihre Funktion zu erfüllen, muss gewährleistet werden, dass sie ihren Zielort sicher erreichen, effizient in die Membran inserieren und dort ihre korrekte Tertiärstruktur annehmen. Intensive Studien haben gezeigt, dass in Escherichia coli verschiedene Faktoren für die Zielsteuerung und Insertion von Membranproteinen verantwortlich sind und diese als individuelle Module agieren. Der mechanosensitive Kanal MscL ist ein pentamerer Komplex in der Cytoplasmamembran von E. coli. Als Überdruckventil stellt MscL die Anpassung, der bei unterschiedlichen Umweltbedingungen lebenden Bakterien, an hypoosmotische Stresssituationen sicher. Die zwei Transmembranbereiche des MscL-Monomers sind durch einen periplasmatischen Loop mit einer Länge von 29 Aminosäuren miteinander verbunden. Zunächst wurde der Membraneinbau von MscL anhand von Depletionsstämmen in vivo untersucht (Facey et al., 2007). Durch Derivatisierung eines im periplasmatischen Bereich des MscL-Proteins befindlichen Cysteinrests konnte die Membraninsertion verfolgt werden. Die cotranslationale Zielsteuerung von MscL an die Innenmembran wird über das Signal recognition particle (SRP) vermittelt. Dort inseriert das MscL-Protein unabhängig vom Membranpotential und den Komponenten der Sec-Translokase SecAYEG, YidC ist jedoch für den Insertionsprozess essentiell. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit den molekularen Mechanismen, die der Entscheidung zugrunde liegen, ob die naszierende Polypeptidkette des MscL-Proteins von YidC oder von der Sec-Translokase erkannt und gebunden wird. Zu diesem Zweck wurde der im Periplasma lokalisierte Loop von MscL durch Einfügen negativer oder positiver Ladungen sowie neutraler Aminosäuren verändert und die Auswirkungen auf die Insertion untersucht. Durch Verlängerung des periplasmatischen Bereichs um eine, zwei oder drei negative Ladungen (Aspartatreste) wurde die Insertion von MscL vom Membranpotential und der Sec-Translokase abhängig. Mit jeder zusätzlichen Ladung nahm auch die Abhängigkeit von SecYE zu. Für eine effiziente Translokation des Loops mit drei zusätzlichen, neutralen Aminosäuren (Asparagine) war der Sec-Komplex ebenfalls erforderlich. Für die Insertion dieser MscL-Mutanten war SecA nicht notwendig, jedoch waren alle analysierten MscL-Proteine weiterhin strikt YidC-abhängig. Die Fähigkeit dieser veränderten MscL-Proteine funktionelle Pentamere zu bilden, wurde anhand von Wachstumsversuchen und nativer Gelelektrophorese bestätigt. Die Anwesenheit von drei zusätzlichen positiven Argininen sowie von fünf zusätzlichen negativen Aspartaten im periplasmatischen Loop von MscL verhinderte den Einbau in die Lipidschicht. Als logische Konsequenz konnte die Expression dieser beiden MscL-Proteine in Wachstumsversuchen auch keinen Schutz vor osmotisch bedingter Lyse gewährleisten. Eine direkte Interaktion von MscL und den funktionellen MscL-Mutanten mit der Membraninsertase YidC wurde durch in vivo Quervernetzungsexperimente verifiziert. Dabei interagiert YidC mit beiden Transmembranbereichen von MscL. Die Kontaktstellen in YidC entsprachen den bereits für Pf3 coat gezeigten Positionen im zentralen Bereich der Membran. Neben der Bedeutung von YidC für eine effiziente Membraninsertion konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass die Oligomerisierung von MscL zu einem funktionellen Kanal ebenfalls nur in Anwesenheit von YidC stattfindet. KW - Transportsystem KW - Derivatisierung KW - YidC KW - SecYEG CY - Hohenheim PB - Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim AD - Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart UR - http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2012/787 ER -