TY - THES T1 - Biogenese und Virusassembly des filamentösen Coliphagen M13 A1 - Ploß,Martin Y1 - 2012/12/17 N2 - Der Phage M13 ist taxonomisch den Einzelstrang-DNA-Phagen zugeordnet und gehört zur Familie der Inoviridae. Für die Vermehrung verwendet M13 Gram-nega-tive Escherichia coli-Zellen, die F-Pili ausbilden, als Wirt. Durch die Vermehrung wird die Wirtszelle nicht geschädigt. In dieser Arbeit konnten neue Erkenntnisse über die M13-Biogenese erhalten werden, welche den Bereich Infektionsprozess, die Assem-blierung und die Phagensekretion betreffen. Durch Adsorptionsexperimente, in denen das Wirtsbakterium E. coli K38 mit M13-Phagen infiziert wurde, konnte gezeigt werden, dass innerhalb der ersten 5 Minuten die Bindung der Phagen an die Zellen stattfindet und hier aufgrund einer Limitierung der F-Pili pro Zelle maximal 7 Phagen pro E. coli-Zelle binden konnten. Die Insertion des Phagenhüllproteins gp9 in die Zytoplasmamembran der Wirtszelle wurde mit Hilfe antigener Epitope in der N-terminalen Domäne nachgewiesen und es konnte gezeigt werden, dass das YidC-Protein von E. coli dafür benötigt wird. Zudem wurde gezeigt, dass plasmidkodiertes gp9 mit zusätzlich eingebrachten antigenen Epitopen in der N-terminalen Domäne keinen negativen Effekt auf die Assemblierung neuer Phagen-Nachkommen hatte. Daher kann das gp9 durch die Insertion kurzer Peptidsequenzen (17 ? 36 Aminosäuren) für ein ?Phage-Display? verwendet werden. Hinsichtlich der Phagenassemblierung war es möglich, den membranständigen gp1/11-Assembly-Komplex, nach Überexpression in E. coli und Größenausschluß-chromatographie, zu charakterisieren und ihm ein Molekulargewicht von ~ 300 kDa zuzuordnen. Die transmissionselektronenmikroskopische (TEM) Untersuchung des gereinigten gp1/11-Assembly-Komplexes zeigte ringförmige Strukturen mit einem Innendurchmesser von ~ 7 ? 8 nm und einem Außendurchmesser von ~ 11 ? 12 nm. Die Untersuchung der wildtypischen Phagensekretion zeigte, dass nach einer 5-minütigen Latenzphase (Eklipse) die Sekretion neuer Phagen-Nachkommen erfolgte und eine infizierte E. coli-Zelle in einem Zeitraum von 115 Minuten bis zu 925 neue Phagen sekretieren kann, was einer durchschnittlichen Sekretion von 7 Phagen pro Minute entspricht. Durch die M13-Infektion verlängerte sich die Generationszeit der E. coli K38-Zellen von 24 auf 48 Minuten. Die Untersuchung der Phagensekretion und der Phagenreplikation genetisch veränderter Phagen, deren Synthese des Haupthüllproteins gp8 durch das Wirts-bakterium mit Hilfe einer Punktmutation im Phagengenom unterbunden wurde, erfolgte in Wirtszellen mit zusätzlich plasmidkodiertem Gen 8 des Phagen. Es zeigte sich, dass das plasmidkodierte gp8 limitiert war, was eine Verringerung der Phagen-sekretion auf ~ 2 Phagen pro Minute verursachte und die Latenzzeit (Eklipse) auf 12 Minuten verzögerte. Die Sekretion von M13-Phagen aus infizierten E. coli-Zellen konnte mit dem ?Atomic Force Microscope? (AFM) dargestellt und die Phagen am TEM, nach Markierung mit Protein-A konjugiertem Gold, nachgewiesen werden. Die Sekretion von M13-Phagen-Nachkommen begann an den Zellpolen von E. coli und breitete sich im Verlauf von 4 Minuten von diesen zu den Seiten der Zellen hin aus und erstreckte sich nach 16 Minuten über die gesamte Zelloberfläche. KW - Bakteriophage M13 KW - Phagen-Display KW - gp9 KW - YidC KW - gp1/11 CY - Hohenheim PB - Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim AD - Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart UR - http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2012/786 ER -