TY  - THES
T1  - Beiträge zur Verbesserung der Analytik von Mutationen im Protoonkogen Kirsten-ras und epigenetische Untersuchungen zur Eignung von DUSP9/MKP4 als CIMP-Marker
A1  - Jenner,Stefan
Y1  - 2012/11/08
N2  - Die vorliegende Arbeit erstreckt sich über zwei verschiedene Anwendungsfelder, die Beiträge zur Verbesserung der Analytik des kolorektalen Karzinoms liefern sollen. Zunächst wurde eine Ligase-basierte Methode entwickelt, die einen schnellen, kostengünstigen, spezifischen und hochsensitiven Nachweis von Punktmutationen am K-ras-Mutations-Hot-Spot Codon12 und Codon13 ermöglicht. Die Etablierung und Validierung der Technik erfolgte an Patientenmaterial, welches als FFPE-Gewebe vorlag und für das zuvor bereits über konventionelle molekularbiologische Techniken der K-ras-Mutationsstatus ermittelt werden konnte. 
Zudem sollte ein Methodenvergleich zwischen der entwickelten Technik und den konventionellen Techniken erfolgen. Die Auswertung der gLCR-Ansätze geschah jeweils kapillarelektrophoretisch über die ABI310er-Plattform.
Unter den getesteten LCR-Varianten stellte sich die gLCR-Monoplex als robusteste, spezifischste und sensitivste Technik heraus. Das Vorhandensein sehr schwacher Mutationen in Patientenproben, für deren zweifelsfreien Nachweis in den Routineuntersuchungen mehrere konventionelle Techniken eingesetzt werden mußten, gelang mit dieser Technik auf Anhieb. Die einzelnen Signalstärken waren für alle Proben sehr hoch, bei gleichzeitig niedriger Standardabweichung.
Über den Methodenvergleich an einer Verdünnungsreihe konnte die Überlegenheit des gLCR-Prinzips gegenüber den konventionellen Techniken weiter herausgestellt werden. Während der Mutationsnachweis mittels Sanger-Sequenzierung oder Mikroarray-Analyse nur bis zur 1:10-, bzw. 1:100-Verdünnung gelang, konnten unter Anwendung der gLCR-Technik spezifische Signale bis zur 1:1 Mio-Verdünnung detektiert werden. 
Im Routinebetrieb müßte jedoch für jede Mutation eine separate Monoplex-Reaktion durchgeführt werden. Die Monoplex-Technik eignet sich daher nur als Bestätigungstest von schwachen oder zweifelhaften Resultaten, die zuvor über konventionelle Techniken ermittelt wurden. Ein Multiplex-Ansatz wäre wünschenswert, um die Technik auch als Hauptnachweistechnik in der Routinediagnostik einsetzen zu können. Dafür scheint eine diskriminierende Base an den Oligosonden jedoch nicht ausreichend zu sein. In zukünftigen Studien sollte daher ein zusätzlicher Mismatch an der Position (-3), bezogen auf das 3´-Ende der mutationsspezifischen Oligosonde, integriert werden. Auf diese Weise käme es zu einer deutlichen Reduktion der falsch-positiven Signale, wodurch die gLCR-Technik möglicherweise auch als Multiplex-Ansatz einzusetzen wäre.

Im zweiten Aufgabenfeld wurde der Methylierungsstatus der DUSP9/MKP4-Promotorregion untersucht. Durch Methylierung kann die Zugänglichkeit des Promotors, und damit die transkriptionelle Aktivierung eines Gens stark reduziert werden. Beim kolorektalen Karzinom (CRC) kommt es im Tumorgewebe häufig zu einer verstärkten Methylierung der Promotorregion von Tumorsuppressoren, welche mit der Tumorentstehung in Verbindung gebracht wird und im korrespondierenden Normalgewebe nicht zu beobachten ist. Man spricht in diesem Fall von CIMP (CpG-island-methylator-phenotype), welcher einen eigenständigen Tumorphänotyp darstellt und mit weiteren klinischen Aspekten verknüpft ist. Beteiligte Gene werden als CIMP-Marker klassifiziert. Das DUSP9/MKP4-Genprodukt wird als starker Tumorsuppressor dargestellt, ohne dass dessen Eignung als CIMP-Marker beim CRC bisher untersucht worden wäre.
In dieser Studie wurde der Methylierungsgrad der DUSP9/MKP4-Promotorregion an 79 kolorektalen FFPE-Karzinomgeweben und 22 korrespondierenden Normalgeweben quantitativ bestimmt. In der DNA der Tumorgewebe kam es zu einer breiten Fächerung der Methylierungsstärke von annähernd unmethyliert bis annähernd komplett und stark methyliert. Für die 11 am schwächsten methylierten Proben finden sich nur geringe Unterschiede zwischen der Methylierungsstärke von Tumor- und korrespondierenden Normalgeweben. Dem gegenüber wurde bei den 11 Proben mit der stärksten Methylierung eine starke Korrelation mit CRC beobachtet, da in über 80% der Fälle im korrespondierenden Normalgewebe die DNA deutlich schwächer methyliert vorlag. Es kommt somit in diesen Tumorgeweben zu einer aberranten DNA-Methylierung. Desweiteren lagen für die stark methylierten DNA-Extrakte in 9 von 11 Fällen CIMP-Kriterien vor, die bei keinem der 11 schwach methylierten DNA-Extrakte aufzufinden waren. 
Diese Arbeit stellt, soweit veröffentlicht, die erste wissenschaftliche Studie dar, in der eine unterschiedliche Methylierung des humanen DUSP9/MKP4-Promotors zwischen kolorektalen Karzinom- und korrespondierenden Normalgeweben aufgedeckt und ein Zusammenhang mit den CIMP-Kriterien hergestellt werden konnte. Dieser Zusammenhang müßte jedoch in weiteren Studien an einem größeren Probenkollektiv bestätigt werden. Zudem sollten Untersuchungen zum Nachweis von Mikrosatelliteninstabilitäten als weiteres CIMP-Kriterium in die Untersuchungen mit aufgenommen und eine funktionstüchtige Proteinnachweismethode etabliert werden.
KW  - K-ras
KW  - Dickdarmkrebs
KW  - Protoonkogen
KW  - Epigenetik
KW  - Methylierung
CY  - Hohenheim
PB  - Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
AD  - Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart
UR  - http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2012/775
ER  -