TY - THES T1 - Intrazelluläres Trafficking des intestinalen Anionenaustauschers Down-Regulated in Adenoma (DRA;SLC26A3) A1 - Lissner,Simone Y1 - 2012/04/18 N2 - Die elektroneutrale NaCl-Resorption im Intestinaltrakt erfolgt durch parallelen Natrium/Protonen- und Chlorid/Hydrogencarbonat-Austausch vermittelt durch die Transportproteine NHE3 und DRA. Knockout-Mäuse, die an chronischer Diarrhöe leiden, sowie die Kongenitale Chlorid Diarrhöe, bei der ein nicht funktionelles DRA eine lebenslange Diarrhöe hervorruft, heben die Wichtigkeit dieser beiden Transportproteine hervor. Um diese fehlerhafte NaCl-Resorption aufzuklären, müssen die physiologische Regulation beider Transportproteine sowie die verantwortlichen extra- und intrazellulären Signaltransduktionswege aufgedeckt werden. Beide Transportproteine interagieren mit PDZ-Adapterproteinen der NHERF-Familie. Beide Ionenaustauscher sind partiell in Rafts lokalisiert. Eine Störung der Raft-Integrität hat eine verminderte Transportaktivität von NHE3 zur Folge. Des Weiteren ist der Einbau von NHE3 in die Plasmamembran abhängig von dessen partieller Raft-Assoziation und der PI3-Kinase. Auf Grund der funktionellen Kopplung von NHE3 und DRA können die Erkenntnisse zur Raft-Assoziation und zum Einfluss der PI3-Kinase auf die Exozytose von NHE3 als Paradigma für DRA gelten. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde daher untersucht, welche Rolle die partielle Raft-Assoziation von DRA für dessen Plasmamembranexpression und Transportaktivität spielt sowie welchen Einfluss die PI3-Kinase hat. Es konnte Folgendes gezeigt werden: (A) Eine Störung der Raft-Integrität führt zu eine Reduktion des durch DRA vermittelten Chlorid/Hydrogencarbonat-Austausches. In HEK-Zellen war die Inhibition der Transportaktivität abhängig von dem Vorhandensein des PDZ-Interaktionsmotivs. In Caco-2/BBE-Zellen war hingegen die Inhibition des durch DRA vermittelten Chlorid/Hydrogencarbonat-Austausches nur teilweise abhängig von der PDZ-Interaktion. (B) Eine Störung der Raft-Integrität hat eine Reduktion der Oberflächenexpression von DRA zur Folge, nicht jedoch von DRA-ETKFminus, einer Mutante, der das PDZ-Interaktionsmotiv fehlt. (C) Die basale Transportaktivität sowie Oberflächenexpression von DRA wird gesteuert von der PI3-Kinase in Abhängigkeit vom PDZ-Interaktionsmotiv. (D) Lipid Rafts und die PI3-Kinase beeinflussen denselben Trafficking-Pfad von DRA, wobei eine Inhibition der PI3-Kinase keinen Einfluss auf die Raft-Assoziation von DRA hat und eine Störung der Raft-Integrität die Kinaseaktivität der PI3-Kinase hingegen nicht hemmt. Diese Ergebnissen deuten darauf hin, dass die Insertion von DRA in die Plasmamembran intakte Lipid Rafts, eine aktive PI3-Kinase sowie die Interaktion mit einem oder mehreren PDZ-Adapterproteinen erfordert. Um das Zusammenspiel von Lipid Rafts, PI3-Kinase und PDZ-Adapterproteinen in Bezug auf die Exozytose von DRA besser charakterisieren zu können, wurde der Recycling-Weg von DRA ? vom frühen Endosom zum recycling Endosom bzw. späten Endosom ? untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass der lysosomale Abbau von DRA-ETKFminus schneller als der lysosomale Abbau von DRA erfolgt, obwohl DRA und DRA-ETKFminus zu gleichen Anteilen an der Plasmamembran exprimiert werden. Auch wurde gefunden, dass die endosomale Verteilung von DRA abhängig von dessen PDZ-Interaktionsmotiv ist. In recycling Endosomen findet sich hauptsächlich Wildtyp-DRA, aber kein DRA-ETKFminus. Dieses findet sich dafür zu größeren Anteilen in späten Endosomen (C) Darüberhinaus zeigte sich, dass dominant negatives Rab11a (Rab11aS25N) eine Reduktion der Transportaktivität und Oberflächenexpression von DRA zur Folge hat. Zusammenfassend konnte in der vorliegenden Arbeit somit gezeigt werden, dass ein enges Zusammenspiel zwischen PDZ-Interaktion, Lipid Raft-Assoziation, PI3-Kinase und der Transportaktivität sowie Plasmamembranexpression von DRA besteht. Die endosomale Verteilung von DRA ist abhängig von dessen PDZ-Interaktionsmotiv und DRA gelangt über Rab11a-haltige recycling Endosomen zur Plasmamembran. KW - Biomembran KW - Exocytose KW - Endocytose KW - Endosom KW - Phosphatidylinositolkinase KW - Cholesterin KW - Ionenaustauscher CY - Hohenheim PB - Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim AD - Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart UR - http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2012/696 ER -