RT Dissertation/Thesis
T1 Untersuchungen zur autonomen und YidC-vermittelten Membraninsertion von Pf3 coat-Protein mit Hilfe Fluoreszenz-spektroskopischer Einzelmolekülmessungen
A1 Schönbauer,Anne-Kathrin
WP 2011/12/08
AB Das Haupthüllprotein des Bakteriophagen Pf3, Pf3 coat, ist ein 44 Aminosäuren großes, alpha-helikales, stäbchenförmiges Protein. Auf Grund seiner geringen Größe und der einfachen Struktur wird es nach der Synthese im Cytoplasma mit Hilfe der Insertase YidC in die Membran eingebaut. Dort setzen sich die Pf3 coat-Proteine zur Phagenhülle zusammen. 
Die Proteinvariante 3L-Pf3 coat besitzt einen verlängerten, transmembranen Bereich durch die Einführung von drei zusätzlichen Leucinen zwischen den Aminosäuren Ile26 und Ile27. Zusätzlich ist die Hydrophobizität dieser Domäne erhöht. Das Protein ist in der Lage, sich unabhängig von YidC in eine Membran einzubauen (Serek et al., 2004). 
In dieser Arbeit wurde mit Hilfe einer neu entwickelten physikalischen Messmethode anhand weiterer Proteinvarianten untersucht, ob die Verlängerung der transmembranen Domäne (TMD), oder aber die Erhöhung der Hydrophobizität für den autonomen Membraneinbau die zentrale Rolle spielt. Dafür wurden zwei Proteinvarianten konzipiert, die jeweils eine der veränderten Eigenschaften des 3L-Pf3 coat-Proteins tragen. Das verlängerte Protein GAT-Pf3 coat trägt bei gleichbleibender Hydrophobizität drei zusätzliche Aminosäuren (Glycin, Alanin und Threonin) in der TMD. Die zweite Proteinvariante, 2M-Pf3 coat, besitzt durch den Austausch der Aminosäuren Ala30 und Ala31 gegen zwei Methionine bei unveränderter Länge der TMD eine erhöhte Hydrophobizität.
Für den Einsatz optisch-physikalischer Messmethoden wurden die Proteine mit einem Fluoreszenz-farbstoff verbunden. Dafür wurde ein Cysteinrest des Proteins über eine Maleimid-Verbindung mit dem Fluoreszenzfarbstoff Atto520-maleimid markiert. Pf3 coat-Protein selbst enthält keine Cysteinreste. Daher erhielten die NC-Varianten, und auch das wildtypische Pf3 coat-Protein, einen Aminosäureaustausch an Position 3 (NC-Pf3 coat). Dort wurde ein Serin gegen ein Cystein ausgetauscht. Im Falle von wt-Pf3 coat und 3L-Pf3 coat wurden außerdem CC-Varianten hergestellt. Hier wurde das C-terminale Phenylalanin gegen ein Cystein ausgetauscht. So konnte zusätzlich zum Einbau die Orientierung des Proteins in der Membran bestimmt werden.
Mit Hilfe der markierten Proteine wurde die Methode der optisch-physikalischen Einzelmolekül-messung entwickelt, mit deren Hilfe man den Einbau des Proteins in DOPC-Liposomen in Echtzeit verfolgen konnte. Durch die Nutzung der Fluoreszenzlöschung konnte dabei zwischen der Bindung an die Membran und dem Einbau unterschieden werden. Es wurde festgestellt, dass sowohl eine Verlängerung der TMD als auch eine gesteigerte Hydrophobizität einen autonomen Einbau in die Membran bewirken können.
K1 Biomembran
K1 Fluoreszenz
K1 Pf3 coat
K1 EInzelmolekülmessung
K1 Hydrophobizität
PP Hohenheim
PB Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
UL http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2011/661