TY  - THES
T1  - Molekulare Dynamik der YidC-Membraninsertase aus Escherichia coli
A1  - Imhof,Nora
Y1  - 2011/12/01
N2  - Die YidC-Insertase des Gram-negativen Bakteriums E. coli ermöglicht die Insertion von Proteinen in die Cytoplasmamembran. YidC selbst ist ebenfalls in der Cytoplasmamembran lokalisiert und durchspannt diese mit sechs Transmembrandomänen. Dabei sind der N- und der C-Terminus im Cytoplasma lokalisiert. Die sechs Transmembrandomänen werden durch drei periplasmatische Bereiche (P1, P2 und P3) und zwei im Cytoplasma lokalisierte Bereiche(C1 und C2) verbunden. Es ist bekannt, dass durch die Bindung des YidC-abhängigen Proteins Pf3 coat Konformationsänderungen in der Tertiärstruktur von YidC verursacht werden. Diese molekulare Dynamik von YidC wurde in dieser Arbeit mittels ?steady-state? und zeitaufgelöster Fluoreszenzspektroskopie genauer untersucht. Dafür wurden drei YidC-Tryptophanmutanten verwendet, die an Position 354 in der ersten periplasmatischen Domäne P1, an Position 454 im zweiten periplasmatischen Bereich P2 bzw. an Position 508 nahe des dritten periplasmatischen Bereichs P3 jeweils einen Tryptophan-Rest enthielten. Zusätzlich wurde eine Doppel-Tryptophanmutante verwendet, die zwei Tryptophan-Reste in der P1-Domäne an Position 332/334 enthielt. Diese Tryptophan-Reste dienten als intrinsische Fluorophore. Zunächst wurde gezeigt, dass die YidC-Tryptophanmutanten den Wachstumsdefekt des E. coli YidC-Depletionsstammes JS7131 komplementieren konnten und zudem in der Lage waren, das strikt von YidC abhängige Protein PClep in die Cytoplasmamembran des Depletionsstammes zu inserieren. Dies stellte sicher, dass die YidC-Tryptophanmutanten funktionell waren. Die gereinigten YidC-Tryptophanmutanten wurden in Liposomen rekonstituiert und mit Pf3W0 coat, einer Tryptophan-freien Mutante von Pf3 coat, titriert. Dies ermöglichte spektroskopische Untersuchungen jedes einzelnen periplasmatischen Bereichs (P1, P2 und P3) von YidC vor und nach Bindung von Pf3W0 coat Protein. Analysen der Emissionsspektren und der Fluoreszenz-Lebensdauern der Detergenz-solubilisierten sowie der rekonstituierten YidC-Tryptophanmutanten vor Bindung von Pf3 coat ließen darauf schließen, dass sich der jeweilige Tryptophan-Rest der Einzel-Tryptophanmutanten (YidCW354, YidCW454 und YidCW508) in der Grenzschicht von Wasser und Membran befand. Diese Ergebnisse sind vereinbar mit der bisher bekannten Membrantopologie von YidC. Die Tryptophan-Reste der Doppel-Tryptophanmutante (YidC2W) wiesen Fluoreszenzeigenschaften auf, die in Einklang mit der bekannten Struktur der P1-Domäne stehen, wonach sie sich in einem teilweise zugänglichen, alpha-helikalen Bereich befinden. Die Analyse der Emissionsspektren und der Fluoreszenz-Lebensdauern führten des Weiteren zur Erkenntnis, dass durch Bindung des Pf3W0 coat Proteins Konformationsänderungen in allen drei periplasmatischen Bereichen (P1, P2 und P3) von YidC stattfanden. Anisotropie-Messungen zeigten, dass diese Konformationsänderungen zu Bewegungen der Tryptophan-Reste in allen drei periplasmatischen Bereichen der YidC-Tryptophanmutanten führten, wobei die periplasmatische Domäne P1 mit den Tryptophan-Resten W332/W334 und der dritte periplasmatische Bereich P3 mit dem Tryptophan-Rest W508 am signifikantesten betroffen waren.
KW  - Rekonstitution
KW  - Fluoreszenzspektroskopie
KW  - Tryptophan
KW  - Liposomen
KW  - Escherichia coli
CY  - Hohenheim
PB  - Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
AD  - Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart
UR  - http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2011/659
ER  -