TY - THES T1 - Tth-IM60, eine Membraninsertase aus Thermus thermophilus A1 - Meyer,Susanne H. Y1 - 2011/12/01 N2 - Die Proteine der evolutionär konservierten YidC/Oxa1/Alb3-Familie sind an der Insertion von integralen Membranproteinen in Bakterien, Mitochondrien und Chloroplasten beteiligt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Protein Tth-IM60 aus Thermus thermophilus als Mitglied dieser Familie identifiziert, sowie funktionell und strukturell näher charakterisiert. So konnte mit Komplementationsstudien, die in vivo mit einem Escherichia coli YidC-Depletionsstamm durchgeführt wurden, gezeigt werden, dass Tth-IM60 das YidC Protein funktionell ersetzen kann. Außerdem konnte Tth-IM60 heterolog in E. coli C43 Zellen im pMS-Vektor mit einem C-terminalen His-tag exprimiert werden. Bei der Solubilisierung zeigte sich, dass das Protein in der Zelle vermutlich als Dimer vorliegt, allerdings nach der Reinigung dazu tendiert in einen höheren Oligomerzustand überzugehen, der nicht spezifiziert werden konnte. In diesem Zustand ist das Protein jedoch für mindestens 50 Tage sehr stabil. Mit Hilfe von Größenausschluss-chromatographien konnten das zwitterionische Detergenz LDAO und der Puffer aus 20 mM TrisHCl pH 8,5, 500 mM NaCl und 10 % Glyzerin als optimal für die Stabilität und Reinigung identifiziert werden. In diesem Puffer gelang es, das Protein über zwei Affinitäts- und eine Gelfiltrationschromatographie als Dimer zu reinigen und eine Konzentration von 10 mg/ml Protein als Voraussetzung für projektierte Kristallisations-versuche zu erreichen. Mit in vitro Pulldown-Assays konnte eine schwache Bindung zwischen Tth-IM60 und der ersten periplasmatischen Domäne von SecF nachgewiesen werden, die auf eine Sec-abhängige Funktion von Tth-IM60 schließen lässt. Des Weiteren konnte die als essentiell beschriebene Sec-unabhängige YidC-Funktion durch die Translokation des YidC-Substratproteins Pf3 coat in Tth-IM60 Proteoliposomen mittels Einzelmolekül-spektroskopie nachgewiesen werden. Kinetische Versuche ließen darauf schließen, dass die Translokation von Pf3 coat Protein innerhalb von fünf Minuten abgeschlossen ist. Strukturanalysen von Tth-IM60 mittels Zirkulardichroismusspektroskopie zeigten einen Anteil von 49 ? 55 % alpha-Helix, 13 - 14 % beta-Faltblatt, 14 ? 17 % beta-Schleife und 18 - 21% ungeordnete Sekundärstruktur. Im Vergleich zu YidC besitzt Tth-IM60 einen deutlich höheren alpha-helikalen und einen niedrigeren beta-Faltblatt Anteil, der mit dem deutlich kürzeren periplasmatischen Loop erklärbar ist. Der Schmelzpunkt von Tth-IM60 liegt bei 68 °C und ist damit um 10 °C höher als der von YidC. Außerdem gelang es, das Tth-IM60 Protein zu kristallisieren und erste Diffraktionstests durchzuführen. Aufgrund der bislang zu geringen Auflösung konnte die Struktur jedoch noch nicht abschließend aufgeklärt werden. In einem zweiten Teil dieser Arbeit konnte auch das ?translocating chain-associated membrane? (TRAM) Protein aus X. laevis in E. coli C43 als Fusionsprotein mit N-terminalem MBP (Maltosebindeprotein) und C-terminalem His-tag heterolog exprimiert werden. Dieses Protein ist zusammen mit dem Sec61-Komplex an der Insertion von integralen Membranproteinen im Endoplasmatischen Retikulum (ER) beteiligt. Im Gegensatz zu den Sec-Komponenten gibt es im ER jedoch kein homologes YidC Protein. Daher könnten funktionelle Ähnlichkeiten zwischen TRAM und YidC existieren. Das TRAM Protein konnte mittels zweier verschiedener Affinitätschromatographien (IMAC und Amylose) gereinigt und anschließend in Liposomen rekonstituiert werden. Translokationsstudien mit Pf3 zeigten eine sehr schwache Bindung und sehr geringe Einbausignale, vergleichbar mit Liposomen. Auch in vivo Komplementationsstudien zeigten keine funktionelle Aktivität von TRAM, die YidC in E. coli ersetzen kann. Nach diesen Ergebnissen konnte dem TRAM Protein keine YidC vergleichbare zelluläre Funktion zugewiesen werden. KW - Heterologe Genexpression KW - Thermus thermophilus KW - YidC KW - TRAM CY - Hohenheim PB - Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim SN - 978-3-8439-0155-0 AD - Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart UR - http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2011/646 ER -