RT Dissertation/Thesis T1 Molekulare Interaktionen von Milchsäurebakterien mit enterohämorrhagischen Escherichia coli und humanen Darmepithelzellen A1 Stöber,Helen WP 2011/07/18 AB Es wurden die Wechselwirkungen von potentiellen probiotischen Bakterienstämmen der Gattungen Bifidobacterium, Lactobacillus und Staphylococcus mit enterohämorrhagischen Escherichia coli (EHEC) im Zellkulturmodell (HT29-Zellen) untersucht. Es wurden 19 potentielle probiotische Stämme sowie fünf EHEC-Stämme mit verschiedenen Virulenzprofilen ausgewählt und Infektionsversuche durchgeführt. Keiner der potentiellen probiotischen Stämme zeigte eine Induktion der IL-8 Sekretion der infizierten Zellen, wohingegen alle EHEC-Stämme unabhängig von ihrem Virulenzprofil die Bildung von IL-8 in ähnlicher Menge induzierten. In Co-Infektionsversuchen mit E. coli O157:H7 Stamm EDL933 und den zu testenden benignen Bakterien wurden hemmende Effekte auf die IL-8 Sekretion der infizierten HT29-Zellen festgestellt. Von 19 untersuchten Stämmen zeigten 12 Stämme eine sehr geringe Absenkung der IL-8 Bildung der infizierten Zellen von < 30 %), sechs Stämme zeigten einen protektiven, anti-inflammatorischen Effekt auf die infizierten Epithelzellen, die IL-8 Produktion wurde um bis zu 60 % abgesenkt. Den stärksten Effekt zeigte B. breve DSMZ 20213 mit einer Absenkung der IL-8 Sekretion von 73 %. Bei der Durchführung von Co-Infektionsversuchen mit verschiedenen Stämmen einer Spezies (B. adolescentis DSMZ 20083 und DSMZ 20086 sowie L. johnsonii BFE 633 und DSMZ 10533) konnte gezeigt werden, dass es sich bei dem beobachteten anti-inflammatorischen Effekt um einen Stamm-spezifischen Effekt handelt, da jeweils nur bestimmte Stämme einer Spezies diesen Effekt auslösen konnten. In nachfolgenden Co-Infektionsversuchen mit den zu testenden Bakterien und den weiteren vier EHEC-Stämmen unterschiedlicher Serotypen und Virulenzprofile, zeigte sich zudem ein Pathogen-spezifischer Effekt. Der gemessene anti-inflammatorischer Effekt variierte je nach eingesetztem pathogenen EHECStamm. In weiteren Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass der beobachtete antiinflammatorische Effekt nur mit lebenden Bakterien erzielt werden konnte. Weder der Kulturüberstand von lebenden Bakterien noch inaktivierte Bakterien konnten einen Effekt auf die IL-8 Sekretion der mit EDL933 infizierten Zellen hervorrufen. Mittels High Performance Liquid Chromatography (HPLC) wurden in den Überständen der Zellkulturen 6 h nach erfolgter Infektion Milchsäure und Essigsäure detektiert. Der Einsatz dieser organischen Säuren in Infektionsversuchen mit EDL933 im Zellkulturmodell zeigte jedoch keinen signifikanten Einfluss auf die IL-8 Sekretion der infizierten Zellen. Der protektive anti-inflammatorische Effekt kann somit nicht mit dem Einfluss gebildeter Säuren begründet werden. Die Induktion der IL-8 Sekretion konnte ebenfalls nicht auf einen einzelnen Virulenzfaktor zurückgeführt werden. In Infektionsversuchen mit vier Deletionsmutanten des Stammes PMK5, bei denen jeweils eines der Virulenzgene ausgeschaltet war, wurden im Vergleich zur Infektion mit dem Wildtyp-Stamm ähnliche IL-8 Sekretionen der HT29-Zellen gemessen. In Co-Infektionsversuchen mit S. pasteuri LTH 5211 und den vier Deletionsmutanten zeigten sich im Vergleich zu dem Co-Infektionsversuch mit dem Wildtyp Stamm ähnliche IL-8 Reduktionen, so dass davon auszugehen ist, dass S. pasteuri LTH 5211 die IL-8 Sekretion der mit PMK5 infizierten HT29-Zellen nicht auf der Beeinflussung eines einzelnen Pathogenitätsfaktors beruht. Die Untersuchung der Aktivierung des der IL-8 Produktion vorgeschalteten Transkriptionsfaktors?Nuklearer Faktor-kappa B? (NF-κB) in HT29-Zellen ergab für Co-Infektionsversuche eine deutlich niedrige Aktivität, als die reine EHEC-Infektion. Dies bestätigt die Ergebnisse der IL-8 Messungen, wobei weder eine Stamm- noch eine Pathogenspezifität festgestellt werden konnte. Zellstimulationen mit den potentiellen probiotischen Bakterien alleine führten zu einer Hemmung der NF-κB-Aktivität, da die gemessenen Werte niedriger als die Negativkontrolle ausfielen. Eine Genexpressionsanalyse von Toll-like-Rezeptoren, welche Bakterien auf der Zelloberfläche erkennen und die Immunantwort initiieren, zeigte für den TLR2 in dem verwendeten Zellkulturmodell keine Regulation. Die Infektion mit EDL933 reguliert den TLR4 herunter und den TLR9 hinauf. In Co-Infektionsversuchen mit L. rhamnosus GG, L. johnsonii DSMZ 10533 oder L. fermentum DSMZ 20052 und EDL933 konnte kein Einfluss auf die von EDL933 ausgelöste Regulierung des TLR4 festgestellt werden. Die durch die EHEC-Infektion ausgelösten Genexpression von TLR9 hingegen wurde durch die Co-Infektion signifikant reduziert. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass es möglich ist im Zellkulturmodell protektive Effekte von Probiotika auf die Infektion mit EHEC zu messen. K1 EHEC K1 Milchsäurebakterien K1 Darmepithel K1 Zellkultur K1 Interaktion PP Hohenheim PB Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim UL http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2011/613