TY  - THES
T1  - Membraninsertion des Phagenproteins M13 procoat in Lipidvesikel mit rekonstituiertem Escherichia coli YidC
A1  - Stiegler,Natalie
Y1  - 2011/06/30
N2  - Die Translokation von Proteinen über und in die Cytoplasmamembran von Escherichia coli kann über verschiedene Mechanismen bewerkstelligt werden. Die zelluläre Sekretionsmaschinerie, die Translokase SecYEG, transportiert mithilfe der ATPase SecA große ungefaltete Proteine ins Periplasma oder leitet Membranproteine an die Insertase YidC weiter. Die Membraninsertion wird von YidC katalysiert, wodurch die native Konformation der Proteine in der Lipid-doppelschicht erreicht wird. Die Translokation einiger weniger Membranproteine verläuft Sec-unabhängig nur mithilfe der Insertase YidC. Eines dieser Sec-unabhängigen Proteine stellt das Haupthüllprotein des Bakteriophagens M13 dar. Dieses Protein wird als Präprotein, genannt M13 procoat, mit der Orientierung Nin-Cin in die innere Membran inseriert und besitzt eine zentrale Loop-Domäne im Periplasma. Dieser Vorgang wird vom elektrochemischen Membran-potential und YidC katalysiert. Anschließend wird das M13 procoat durch die Leaderpeptidase zu seiner maturen Form, M13 coat (Orientierung Nout-Cin), prozessiert.
Die vorliegende Arbeit befasst sich anhand des Modellproteins M13 procoat und M13 procoat-Mutanten mit der Analyse der verschiedenen Transportsysteme der inneren Membran. Eine Mutante ist das Procoat H5EE, welches zwei zusätzliche saure Aminosäurereste zwischen Position +2 und +3 besitzt. Die Insertion dieser Mutante benötigt die Sec-Translokase und ist strikt vom Membranpotential abhängig. Die Membraninsertion von M13 procoat und abgeleiteten Proteinen in die cytoplasmatische Membran wurde in einem in vitro-Rekonstitutions- und Translokationssystem untersucht. Hierfür wurden die einzelnen Komponenten der Sec-Translokase (SecYEG und SecA), die Insertase YidC, sowie die verschiedenen Procoatproteine gereinigt und in dem in vitro-Translokationssystem eingesetzt. Die Rekonstitution von YidC in Phospholipidvesikel erfolgte abhängig von der Lipid-zusammensetzung der Membran. Die cytoplasmic-out-Orientierung entspricht der aktiven Topologie in E. coli mit den Termini im Cytoplasma. Einige Lipidkompositionen verursachten die Inversion der Orientierung, wodurch die katalytische Aktivität der Insertase beeinträchtigt wurde. 
Die Procoatmutanten H5 und H5EE wurden nur in Anwesenheit von rekonstituiertem YidC in die Membran inseriert. Beide Proteine inserierten effizient in die Vesikel mit den Termini nach außen und dem periplasmatischen Loop im Inneren der Vesikel, wie die Mutante PClep von Procoat H5 mit dem C-terminalen Teil der Leaderpeptidase. Spontaninsertion in Liposomen fand nur in undichte Vesikel aus E. coli Lipiden statt. Die Membranintegrität konnte durch die Zugabe einer ausreichenden Menge an Diacylglycerin (DAG) zu den Phospholipiden verhindert werden. Undichte Phospholipide konnten durch das Zufügen von 3-4% DAG repariert werden. Die Proteine H5 und H5EE zeigten auch in vitro eine Abhängigkeit vom Membranpotential. Sie wurden effizienter in YidC-Proteoliposomen inseriert, wenn ein stabiles Membranpotential vorhanden war. Proteoliposomen mit rekonstituierter SecYEG-Translokase wurden ebenfalls auf Proteininsertion getestet. Erstaunlicherweise inserierte das Protein M13 procoat H5EE effizient in SecYEG-Proteoliposomen, nicht aber das wildtypische H5-Protein. 

KW  - Rekonstitution
KW  - M13 procoat
KW  - YidC
KW  - SecYEG
KW  - Liposomen
CY  - Hohenheim
PB  - Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
AD  - Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart
UR  - http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2011/608
ER  -