TY - THES T1 - Heterologe Expression und molekulare Charakterisierung des Dirigentproteins AtDIR6 aus A. thaliana A1 - Pickel,Benjamin Y1 - 2011/05/24 N2 - Dirigentproteine sind an der stereo- und regiospezifischen Kontrolle in der Biosynthese von Sekundärmetaboliten beteiligt. Funktional charakterisierte Dirigentproteine aus Forsythia intermedia und Thuja plicata kuppeln Koniferylalkoholradikale spezifisch zu (+)-Pinoresinol, einem Vorläufermolekül vieler Lignane, unter anderem des pharmazeutisch bedeutsamen Podophyllotoxin. Der Nachweis von (?)-Lariciresinol in A. thaliana Wurzeln und die Akkumulation des im Lignanbiosyntheseweg vorangehenden (?)-Pinoresinol in Pinoresinolreduktase defizienten Mutanten weist auf die Existenz einer neuartigen Dirigentaktivität in A. thaliana hin, die die enantiokomplementäre Bildung von (?)-Pinoresinol vermittelt. In der vorliegenden Arbeit wurde AtDIR6 als Kandidat für die enantiokomplementäre Dirigentaktivität identifiziert. Das Protein wurde kloniert und heterolog in einem pflanzlichen Zellsystem exprimiert. Das exprimierte Protein wurde mit konventionellen Chromatographiemethoden bis zur apparenten Reinheit aufgereinigt. Das aufgereinigte AtDIR6 war funktionell aktiv und vermittelte die Bildung von (?)-Pinoresinol aus Koniferylalkoholradikalen in vitro. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Stereoselektivität von AtDIR6 derjenigen der bekannten Dirigentproteine aus F. intermedia und T. plicata entgegengesetzt ist. AtDIR6 ist damit das erste funktionell charakterisierte enantiokomplementäre Dirigentprotein. AtDIR6 besitzt ein N-terminales Signalpeptid, das während der Sekretion zwischen der Aminosäure 29 und 30 abgespalten wird. Das prozessierte AtDIR6 akkumulierte extrazellulär und verblieb nichtkovalent an die primäre Zellwand der Zellen gebunden. Das native Protein besitzt zwei komplexe bzw. paucimannosidische N-Glykane, formt Homodimere von ca. 42 kDa und weist einen hohen Anteil an b-Faltblattstrukturen auf. Die funktional beschriebenen Dirigentproteine sind kleine Proteine, die reaktive Koniferylalkoholradikale binden und enantioselektiv kuppeln ohne eine eigenständige katalytische Aktivität aufzuweisen. Die Sequenzidentität verschiedener Dirigentproteine ist zum Teil sehr gering. In diesen Aspekten ähneln die Dirigentproteine den Lipocalinen. Ein Sequenzvergleich von Lipocalinen mit Dirigentproteinen zeigte, dass das lipocalinspezifische Sequenzmotiv im Bereich der SCR II in Dirigentproteinen konserviert ist. Die strukturellen und mechanistischen Eigenschaften von AtDIR6 lassen vermuten, dass Dirigentproteine Teil der Calycin Superfamilie sind, zu der auch die Lipocaline gehören und ihre dreidimensionale Struktur vermutlich einem b-Fass entspricht. KW - Ackerschmalwand KW - Enantioselektivität KW - Lignane CY - Hohenheim PB - Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim AD - Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart UR - http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2011/599 ER -