RT Dissertation/Thesis
T1 Molekulargenetische Untersuchungen zur Expression des Typ III Effektors NleA 4795 von Shiga Toxin-produzierenden Escherichia coli 
A1 Schwidder,Maike
WP 2011/03/16
AB Shiga Toxin-produzierende E. coli (STEC) gelten weltweit als wichtige Erreger von lebensmittelbedingten Infektionen und können zu schweren Erkrankungen wie der hämorrhagischen Colitis und dem lebensbedrohlichen hämolytisch-urämischen Syndrom führen. Die Bakterien kolonisieren den Dickdarm des Menschen, wo sie in der Regel zur Ausbildung von charakteristischen ?Attaching und Effacing?-Läsionen führen. Verantwortlich dafür ist eine Pathogenitätsinsel, bezeichnet als ?Locus of Enterocyte Effacement? (LEE), sowie die darauf kodierten Komponenten eines Typ III Sekretionssystems, über das die Bakterien Effektorproteine direkt in die Wirtszellen injizieren können. Zusätzlich zu den LEE-kodierten Effektoren existiert eine große Anzahl an Effektorproteinen, deren kodierende Sequenzen außerhalb der Pathogenitätsinsel lokalisiert sind. Darunter auch der ?Non-LEE encoded Effector A? (NleA), der im Genom von kryptischen oder induzierbaren Prophagen kodiert ist und unter den pathogenen E. coli Stämmen weitverbreitet vorkommt. 
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Expression und Regulation der nleA-Variante nleA4795 des E. coli O84:H4 Stammes 4795/97 untersucht, welche auf dem Shiga Toxin-konvertierenden Phagen BP-4795 lokalisiert ist. Dabei wurde mit Hilfe eines Luciferase-Reportersystems und der quantitativen Real-Time PCR der Einfluss von verschiedenen Umweltreizen getestet sowie die Abhängigkeit der nleA4795-Expression von bestimmten Regulatorproteinen untersucht. Unter den analysierten Umweltbedingungen kristallisierten sich bestimmte NaCl- und KCl-Konzentrationen als induzierend für die Expression von nleA4795 heraus und lassen daher auf eine osmotisch bedingte Aktivierung schließen. Eine zunächst vermutete Induktion der nleA4795-Expression durch Quorum Sensing in vorkonditioniertem Medium konnte nicht nachgewiesen werden, da keiner der bislang bekannten Autoinducer einen positiven Einfluss ausübte. Die erhöhte Expression von nleA4795 konnte nachfolgend mit einem reduzierten Nährstoffgehalt assoziiert und somit eine Korrelation zwischen der nleA4795-Expression und bakteriellen Stressantwort-Systemen hergestellt werden. Des Weiteren wurde untersucht, ob ein Zusammenhang zwischen der nleA4795-Expression und der Induktion des Phagen BP-4795 sowie der damit verbundenen Expression von Shiga Toxin besteht. Durch Induktionsexperimente mit Norfloxacin konnte jedoch im Gegensatz zur Expression von Shiga Toxin keine Aktivierung, sondern eine starke Repression der nleA4795-Expression nachgewiesen werden.
Die Untersuchungen auf regulatorischer Ebene zeigten die Abhängigkeit der nleA4795-Expression von den drei LEE-kodierten Regulatoren Ler, GrlA und GrlR sowie von den außerhalb des LEE kodierten Pch-Regulatoren. Für den ebenfalls außerhalb der Pathogenitätsinsel kodierten Regulator EtrA konnte kein Einfluss auf die Expression von nleA4795 nachgewiesen werden. Zudem wurden die Regulatorproteine Ler, GrlA und PchA mit Hilfe von Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) auf eine direkte Bindung an die nleA4795-Promotorregion untersucht. Die beiden Regulatoren GrlA und PchA zeigten jedoch keine spezifische Bindung und wurden demzufolge als indirekte Regulatoren der nleA4795-Expression einstuft. Für den Regulator Ler konnte hingegen eine direkte Bindung an bestimmte Bereiche der nleA4795-Promotorregion nachgewiesen und somit eine Integration von nleA4795 in den Ler-vermittelten Regulationskreis des LEE bestätigt werden.

K1 STEC
K1 Virulenzfaktor
K1 Genregulation
K1 EHEC
PP Hohenheim
PB Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
UL http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2011/583