RT Dissertation/Thesis
T1 Variabilität und Induzierbarkeit von Cytochrom P450 Monooxygenasen in humanen Leberproben und Hepatozyten : Untersuchungen mittels LC-MS/MS Cocktail-Assay und RNA-Interferenz
A1 Feidt,Diana M.
WP 2010/11/23
AB Die Variabilität der Expression und Funktion der P450 Enzyme (CYPs) ist eine der Ursachen dafür, dass bei gleicher Dosierung eines Medikaments Intensität und Dauer von Wirkungen und Nebenwirkungen von Patient zu Patient unterschiedlich sein können. Diese interindividuelle Variabilität der Enzyme lässt sich heute noch nicht lückenlos erklären. Prinzipiell können biologische Faktoren (z.B. Alter, Geschlecht, Hormonstatus), Umweltfaktoren (Ernährung, Rauchen, Arzneimittelinteraktionen) sowie genetische Faktoren, z.B. Polymorphismen, Enzymfunktionen beeinflussen.
Um dieser Problematik nachgehen zu können und auf Aktivitätsebene relativ schnell und einfach Unterschiede nachzuweisen, wurde ein LC-MS/MS basierter P450 Cocktail-Assay zur Quantifizierung der sieben wichtigsten Enzymaktivitäten für den Arzneistoffwechsel entwickelt und in humanen Hepatozyten etabliert.
Am Beispiel der Arzneistoffgruppe der HMG-CoA Reduktasehemmer (Statine) wurden Untersuchungen der Cytochrom P450 Enzyme durch zeitabhängige Enzyminduktionsprofile mittels Cocktail-Assay und mRNA-Expression gemessen.
Das CYP2C8 wurde als neues, von Statinen stark induziertes P450 Enzym identifiziert. Es wurde eine bis zu 20-fache Zunahme der Aktivität durch Atorvastatin und eine ~10-fache Zunahme durch Simvastatin- und Lovastatinbehandlung nachgewiesen. Die Enzyme CYP3A4, CYP2B6 und CYP2C9 zeigten geringere, aber auch deutliche Aktivitätssteigerungen durch die Behandlung mit Atorvastatin und Simvastatin (4 bis 11-fach). Lovastatin und Rosuvastatin hatten geringere Effekte.
Die Expression der mRNA entsprach weitestgehend den Beobachtungen der Aktivitäten, wobei jedoch die Auswirkungen dynamischer und drastischer mit wesentlich höheren Induktionsleveln ausfielen.
Die Ergebnisse deuten auf einen stärkeren Einfluss der Behandlung mit Statinen auf P450 Expression und Aktivität hin, als bisher angenommen. Dies könnte besonders für die Co-Medikation mit anderen über CYP2C8 metabolisierten Arzneistoffen von entscheidender Bedeutung sein.
Aufgrund von Korrelationsanalysen der P450 Enzymaktivitäten zu ihrem spezifischen Proteingehalt in humanen Leberproben (Leberbank am IKP) wurden unterschiedliche Ergebnisse hinsichtlich der Funktion einzelner CYP-Enzyme beobachtet. Manche CYP-Enzyme, wie z.B. CYP3A4 mit der Hydroxylierung von Atorvastatin oder CYP1A2 mit der Bildung von Acetaminophen zeigten sehr gute Korrelationen. Andere Enzyme wie z.B. CYP2C9 mit dem spezifischen Substrat Diclofenac, korrelierten wesentlich schlechter.
Diese Unterschiede könnten neben biologischen Faktoren und Umwelteinflüssen mit Variabilität in den Enzymen NADPH:P450 Oxidoreduktase (POR), Cytochrom b5 oder den beiden Progesteronrezeptor-Membrankomponenten PGRMC1 und PGRMC2 zusammenhängen. Denn als potentielle Elektronendonatoren der CYP-Enzyme wären diese maßgeblich am Metabolismus von Xenobiotika beteiligt.
Zur Untersuchung, welchen Einfluss die Elektronendonator-Proteine auf die Aktivität der CYP-Enzyme haben, wurde die Technik einer lentiviral basierten RNA-Interferenz (RNAi) für diese Gene in primären humanen Hepatozyten entwickelt und die P450 Aktivitäten mittels Cocktail-Assay nach dem »Knock-Down« dieser Gene bestimmt.
Für die P450 Reduktase wurde ein erfolgreiches »Gene Silencing« von durchschnittlich 85% auf mRNA-Ebene erzielt. Die Expression von Cytochrom b5 wurde um 51% reduziert, PGRMC1 um ca. 30%. Für PGRMC2 konnte bisher kein signifikanter »Knock-Down« nachgewiesen werden.
Nach dem »Silencing« der Reduktase wurde für die P450 Enzymaktivitäten nach 4 Tagen durchschnittlich ein leichter Rückgang von ca. 10-30% beobachtet. Nach einer Zeitdauer von 7 Tagen wurde für das CYP3A4 im Vergleich zur Kontrolle nur noch eine Restaktivität von ungefähr 5% detektiert.
Für die beiden anderen potentiellen Elektronendonatoren Cytochrom b5 und PGRMC1 wurde entsprechend eine um 85% bzw. 75% reduzierte CYP3A4 Aktivität nachgewiesen.
Diese ersten Ergebnisse sprechen deutlich für eine Interaktion der Enzyme POR,  Cytochrom b5 und PGRMC1 mit den Arzneistoff metabolisierenden P450 Enzymen.

K1 Cytochrom P-450
K1 Enzyminduktion
K1 RNS-Interferenz
K1 RNA-Interferenz
K1 Statine
PP Hohenheim
PB Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
UL http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2010/520