TY  - THES
T1  - Charakterisierung der Matrixmetalloproteinasen (SlMMP1 & SlMMP2) aus Tomate (Solanum lycopersicum) und ihre Rolle in der pflanzlichen Entwicklung und Pathogeninteraktionen
A1  - Pasule,Christian
Y1  - 2010/12/01
N2  - Ziel der vorliegenden Arbeit war die funktionelle Charakterisierung der Matrixmetalloproteinasen SlMMP1 und SlMMP2 aus Tomatenpflanzen mittels Aufreinigung und biochemischer Charakterisierung der rekombinanten Proteine, detaillierter Expressionsstudien in Tomatenpflanzen, sowie phänotypischer und molekularer Analyse transgener Pflanzen mit veränderter Expression von SlMMP1/2 (SlMMP1/2-RNAi).
Die Enzyme SlMMP1/2 wurden in E. coli exprimiert und mittels Affinitätschromatographie gereinigt. Die Aktivität der rekombinanten MMPs wurde durch Ca2+-Ionen stimuliert. Für SlMMP1 konnte ein Aktivitätsoptimum bei pH 6,5 und für SlMMP2 bei pH 7 gemessen werden. Der apparente Km-Wert für ein fluorogenes Peptidsubstrat wurde für SlMMP1 bei 19,5 µM und für SlMMP2 bei 19,9 µM ermittelt, bei einer katalytischen Effizienz (Kcat/Km) von 0,010 bzw. 0,024 s-1*µM-1. Diese Daten lassen vermuten, dass es sich bei der SlMMP1 und SlMMP2 um Enzyme mit redundanten Eigenschaften handelt.
Die Expressionsanalyse ergab, dass SlMMP1 in allen untersuchten Organen und Entwicklungsstadien exprimiert wird, wobei die stärkste Expression in acht Tage alten Keimlingen und in Stängeln von sechs Wochen alten Pflanzen zu beobachten war.
SlMMP2 zeigte dagegen keine konstitutive Expression in Blättern sechs Wochen alter Pflanzen. In acht Tage alten Keimlingen ist die Expression von SlMMP2 in Wurzel und Hypokotyl deutlich stärker als in Kotyledonen. Die gewebsspezifische Expression von SlMMP1 und SlMMP2 weist darauf hin, dass die Enzyme trotz ähnlicher biochemischer Eigenschaften spezifische Substrate und Funktionen in den jeweiligen Geweben haben könnten.
Mit Hilfe immunohistochemischer Methoden wurde gezeigt, dass SlMMP1/2 in Zellwänden von Hypokotyl und Wurzel lokalisiert ist. Dies bestätigte die Annahme, dass es sich bei SlMMP1/2 um extrazelluläre Enzyme handelt. In transgenen Pflanzen mit verminderter SlMMP1/2 Expression zeigten sich zwei Wochen nach der Keimung Veränderungen in der Oberflächenstruktur der Hypokotyle, die zu nekrotischen Läsionen führten. Mit fortschreitendem Alter der Pflanzen wird das gesamte Hypokotyl von den Nekrosen erfasst. Ebenso zeigen sich veränderte Zellmuster im Kortex und Zelltodereignisse in der Epidermis und in der subepidermalen Zellschicht. Während späterer Entwicklungsstadien werden diese Effekte auch auf Blättern von SlMMP1/2-RNAi-Pflanzen sichtbar. Des Weiteren kommt es zur massiven Akkumulation phenolischer Sekundärmetabolite, sowie zu einer Beeinträchtigung der Wurzelentwicklung in SlMMP1/2-RNAi-Pflanzen, was sich in einer Reduktion der Gesamtwurzellänge und in der Ausbildung primärer und sekundärer Seitenwurzeln äußert.
Viele der beobachteten Effekte in SlMMP1/2-RNAi-Pflanzen lassen eine Beteiligung von Ethylen vermuten. Eine gesteigerte Ethylenproduktion konnte in SlMMP1/2-RNAi-Pflanzen experimentell bestätigt werden.
Mittels Mikroarray Analysen wurde untersucht, in welcher Weise sich der Verlust von SlMMP1/2 auf die Genexpression in Hypokotylen von SlMMP1/2-RNAi-Pflanzen auswirkt. Es wurden 522 Gene identifiziert, welche in Hypokotylen von SlMMP1/2-RNAi-Pflanzen differentiell reguliert sind. Davon waren 332 Gene stärker, und 190 Gene schwächer exprimiert als in Wildtyp-Pflanzen. Erhöht, aber nicht signifikant überrepräsentiert war in den RNAi-Pflanzen der Anteil an Genen, die eine Rolle bei Entwicklungsprozessen, bei Stressreaktionen, bei Reaktionen auf abiotische und biotische Reize spielen, und Gene die bei noch unbekannten biologischen Prozessen beteiligt sind. Der Anteil an Genen mit einer Funktion bei Transportvorgängen ist in RNAi-Pflanzen deutlich erniedrigt.
Nachdem beobachtet wurde, dass die Expression von SlMMP1/2 nach Infektion mit Sclerotinia sclerotiorum induziert wird, wurde eine mögliche Beteiligung in der Pathogenabwehr untersucht. Eine direkte Beteiligung in der Abwehr von Sclerotinia sclerotiorum ist aber auszuschließen, da keine Unterschiede in der Wachstumskinetik des Pilzes auf Wildtyp- oder SlMMP1/2-RNAi-Pflanzen zu erkennen waren.
Des Weiteren wurde überprüft, ob es zwischen SlMMP1/2-RNAi- und Wildtyp-Pflanzen Unterschiede in der Resistenz gegenüber dem biotrophen Pathogen Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv) gibt. Auf SlMMP1/2-RNAi-Pflanzen zeigte sich ein vermindertes bakterielles Wachstum für virulente, avirulente, als auch für nicht pathogene Bakterienstämme, was mit starken Nekrosen in Blättern der SlMMP1/2-RNAi-Pflanzen einherging. Das deutet auf eine regulatorische Funktion von SlMMP1/2 in der unspezifischen Reaktion auf biotische Stressfaktoren.
KW  - Tomate
KW  - Pathogeninteraktion
CY  - Hohenheim
PB  - Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
AD  - Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart
UR  - http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2010/518
ER  -