TY  - THES
T1  - Herstellung und Charakterisierung einer rekombinanten, sequenzspezifischen Protease zur Generierung bioaktiver Peptide
A1  - Hug,Thomas
Y1  - 2010/09/15
N2  - Ziel der vorliegenden Arbeit war es, eine sequenzspezifische, mikrobielle Protease herzustellen, biochemisch zu charakterisieren und mittels dieses Enzyms aus Lebensmittelprotein hydrolytisch bioaktive Peptide zu generieren. Um die Serin-Protease PRT1 aus Xanthomonas campestris pv. campestris bezüglich ihrer Substratspezifität zu untersuchen, wurde dieser Stamm im Schüttelkolben kultiviert. Nach Dialyse des Kulturüberstandes und Zugabe von 1,10-Phenantrolin zur Inaktivierung der Metalloprotease PRT2 konnte eine Enzymaktivität von 0,34 nkat Casein/mL detektiert werden. Der Umsatz verschiedener chromogener Peptidsubstrate zeigte, dass PRT1 keine eindeutige Substratspezifität aufweist. Die Lysyl-Endopeptidase LysC aus Lysobacter enzymogenes ssp. enzymogenes wurde durch Kultivierung des Wildstamms (ATCC 27796) gewonnen. Im Bioreaktor(1 L Arbeitsvolumen) konnte nach 45 h eine maximale Protease-Aktivität von 0,084 nkat Tos-Gly-Pro-Lys-pNA/mL im Kulturüberstand nachgewiesen werden. Das LysCGen wurde mittels PCR aus genomischer DNA amplifiziert und in den E. coli Expressionsvektor pET20b(+) kloniert. Die Expression in E. coli BL21(DE3) führte jedoch zu keiner nachweisbaren Bildung von rekombinanter Protease. Daher wurde ein bereits in der Literatur beschriebenes, synthetisches Genkonstrukt mit verkürzter N-terminaler Prosequenz (MGSK) und an E. coli angepasster ?Codon Usage? für die heterologe Expression untersucht. Die Bioreaktor-Kultivierung (5 L Arbeitsvolumen) von E. coli BL21(DE3) pET20b-MGSK-LysC führte zu rekombinanter LysC, welche in Form von ?Inclusion Bodies? in den Zellen gebildet wurde. Die Solubilisierung der ?Inclusion Bodies? und anschließende Renaturierung des Enzyms mit L-Arginin als unspezifischer Faltungshilfe ergab eine maximale Proteaseaktivität von 0,06 nkat Tos-Gly-Pro-Lys-pNA/L Kultur 5 h nach IPTG-Induktion. Um die Ausbeute an rekombinanter Proteaseaktivität steigern zu können, wurde der Einfluss der beiden LysC-Propeptide auf die in vitro Renaturierung der Protease untersucht. Hierfür wurden die Propeptid-DNA-Sequenzen aufgeklärt, kloniert und in E.coli heterolog exprimiert. Die Zugabe von C-terminalem und N-terminalem Propeptid zur LysC-Renaturierung führte zu einer bis zu 27fachen (1,56 Μkat Tos-Gly-Pro-Lys-pNA/L Kultur) Steigerung der LysC-Aktivität bezogen auf die Renaturierung mit L-Arginin. Als alternatives ?Food-grade? Expressionssystem wurde das in der Literatur etablierte Expressionssytem von Lactobacillus plantarum NC8 bzw. L. sakei Lb790 und dem E. coli-Lactobacillus Shuttle-Vektor pSIP409 eingesetzt. Jedoch konnte weder bei der Schüttelkolben-Kultivierung von L. plantarum NC8 pSIP409-MGSK-LysC noch von L. sakei Lb790 pSIP409-MGSK-LysC rekombinante Lysyl-Endopeptidase nachgewiesen werden. Da als möglicher Grund hierfür die unterschiedliche ?Codon Usage? von E. coli und Lactobacillus angenommen wurde, wurden Expressions-Experimente mit punktmutierten Varianten des beta-Galactosidasegens aus Kluyveromyces lactis durchgeführt. Hierbei zeigte sich, dass der Austausch des Serin-Codons tca bzw. agt gegen tcc einen deutlichen Einfluss auf die resultierende Enzymaktivität hatte. So führte der dreifache Codon-Austausch zu einer Verringerung der beta-Galactosidase-Aktivität um 38 %. Die Charakterisierung der rekombinanten Lysyl-Endopeptidase LysC bestätigte die hohe Substratspezifität für Lysinreste an P1-Position. Das pH- bzw. Temperatur-Optimum lag bei 8,5 bzw. 45°C. Bei 4°C und pH 9 war das Enzym für mindestens 20,5 h stabil, während bei 45°C nach 1 h nur noch 40 % Restaktivität gemessen werden konnten. Eine inhibierende Wirkung auf LysC zeigten Ba2+, NH4+ und PMSF. Die Hydrolyse von bovinem Casein mit LysC generierte die ACE-inhibierenden Peptide EMPFPK, FALPQYLK, NMAINPSK und ALNEINQFYQK sowie das antioxidativ wirkende VLPVPQK, die alle eindeutig mittels LC-ESI-MS/MS detektiert werden konnten. Über entsprechende in vitro Assays wurden die Radikalfänger-Aktivität (IC50 = 4,85 Μg/mL), die Lipoxygenase-Inhibierung (IC50 = 23,6 Μg/mL) sowie die ACE-Inhibierung (IC50 = 2,78 Μg/mL) des Casein-Hydrolysat quantifiziert.
KW  - Peptide
KW  - Endoprotease LysC
KW  - Lysobacter enzymogenes
KW  - Caseinhydrolyse
KW  - bioaktive Peptide
CY  - Hohenheim
PB  - Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
AD  - Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart
UR  - http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2010/497
ER  -