RT Dissertation/Thesis
T1 Rolle von SNARE-Proteinen bei der Mediatorfreisetzung humaner Mastzellen
A1 Frank,Simon P. C.
WP 2010/06/22
AB Mastzellen sind an einer Vielzahl physiologischer und pathophysiologischer Vorgänge im Körper beteiligt. Sie verfügen über ein breites Spektrum an gespeicherten sowie de novo synthetisierten inflammatorisch wirksamen Mediatoren, weshalb sie nicht nur - wie ursprünglich angenommen - bei allergischen Erkrankungen eine wichtige Rolle spielen.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, einen detaillierten Einblick in die Prozesse der Mediatorfreisetzung reifer menschlicher Mastzellen zu vermitteln. Damit es zur Ausschüttung von Histamin, Proteasen, Zytokinen, Chemokinen und anderen Mediatoren kommen kann, müssen sekretorische Vesikel mit der Plasmamembran fusionieren. An diesem Vorgang sind sogenannte SNARE-Proteine essenziell beteiligt. Diese werden allgemein in Vesikel¬membran (v) - und Ziel (target) membran (t) - SNAREs eingeteilt.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass eine ganze Reihe von SNAREs in humanen Darmmastzellen exprimiert werden. Die t-SNAREs SNAP-23, Syntaxin-2, -3, -4, -6 und Vti1b sowie die v-SNAREs VAMP-2, -3, -5, -7, - 8 konnten klar nachgewiesen werden, während SNAP-25, Syntaxin-1b und VAMP-4 nur schwach exprimiert vorliegen. Durch eine anschließende Markierung dieser Proteine mit fluoreszenzgekoppelten Antikörpern konnte deren Lokalisation in der Zelle mikroskopisch dargestellt werden. Es zeigte sich eine deutlich plasmamembranständige Anordnung der t-SNAREs SNAP-23, Syntaxin-3, -4 und -6, während Syntaxin-2, Vti1b, VAMP-3, -7 und -8 in ruhenden Zellen zytoplasmatisch verteilt sind. Nach Aktivierung der Zellen änderte sich diese Anordnung jedoch für VAMP-7 und -8, die nach 15-minütiger Stimulation in Richtung Plasmamembran wanderten sowie Vti1b, das sich nach einer längeren Aktivierungsphase von 2 Stunden ebenfalls an den Zellrand verlagerte. In aktivierten Mastzellen gelang es außerdem, Kolokalisationen von SNAP-23, Syntaxin-3 und -4, VAMP-7 und -8 sowie Vti1b sichtbar zu machen. Mittels Ko-Immunpräzipitation wurden Komplexbildungen von SNAP-23 mit Syntaxin-4, VAMP-7 und -8 bestätigt.
Für die Aufklärung der funktionellen Bedeutung der jeweiligen SNARE-Proteine wurden einzelne SNAREs inhibiert. Hierzu wurden inhibitorische Antikörper in die Zelle eingebracht. Interessanterweise zeigte sich bei einer ganzen Reihe von SNARE-Proteinen eine Beteiligung an Ausschüttungs¬prozessen in Mastzellen. Die Freisetzung der gespeichert vorliegenden Beta-Hexosaminidase wurde durch Antikörper gegen SNAP-23, Syntaxin-3, -4 und -6, VAMP-7 und -8 sowie Vti1b nach einer Stimulationszeit von einer Stunde deutlich reduziert. Erstaunlicherweise schien im Gegensatz dazu VAMP-7 im Falle einer längeren Aktivierungszeit der Zellen von sechs Stunden keine Rolle mehr zu spielen. Die gleichen SNAREs waren außerdem auch für die Freisetzung von LTC4 verantwortlich. Für die Ausschüttung der gemessenen Zytokine und Chemokine IL-5, IL-6, IL-8, MCP-1, MIP-1-alpha und MIP-1-beta zeigte sich eine uneinheitliche Beteiligung von SNARE-Proteinen. Allerdings ergab sich durch die Inhibition von SNAP-23, Syntaxin-3 und Vti1b für alle gemessenen Zytokine eine fast vollständige Blockade der Freisetzung. Des Weiteren verursachten Antikörper gegen Syntaxin-6 eine signifikante Reduktion der Ausschüttung von IL-5, IL-8 und MCP-1 sowie eine tendenzielle Verminderung von IL 6, MIP-1-alpha und MIP-1-beta. Von den v-SNAREs VAMP-7 und -8 schien zum Teil das eine, zum Teil das andere für die Ausschüttung der verschiedenen Zytokine notwendig zu sein. Da für das Chemokin MIP-1-beta weder die Blockade von VAMP-7 noch VAMP-8 einen Effekt hervorriefen, könnte auch noch ein weiteres, nicht untersuchtes Mitglied der VAMP-Familie beteiligt sein. Die Inhibition von Syntaxin-4 führte nur für IL-8 zu einer deutlichen und signifikanten Reduktion der Freisetzung.
Insgesamt konnte gezeigt werden, dass die Freisetzung verschiedener Mediatoren in humanen Darmmastzellen durch unterschiedliche SNAREs katalysiert wird und somit die Existenz spezifischer sekretorischer Vesikel und ein gezielter Transport von Mediatoren sehr wahrscheinlich sind. Eine Erklärung für die Beteiligung einer ganzen Reihe von SNARE-Proteinen an Ausschüttungsprozessen könnte sein, dass für das Ausbilden intrazellulärer Strukturen, die für die compound exocytosis notwendig sind, andere SNAREs verantwortlich sind, als für das Andocken von Vesikeln an der Plasmamembran.
Ein detailliertes Verständnis der Mechanismen und der Beteiligung spezifischer SNARE-Proteine an der Freisetzung verschiedener Mediatoren menschlicher Mastzellen könnte eine Grundlage für neuartige Behandlungsformen von Allergien und Asthma bilden. Neue Therapieansätze könnten darauf abzielen, durch das zeitweilige Ausschalten bestimmter SNARE-Proteine eine gezielte Reduktion der Mediatorenfreisetzung zu erreichen.
K1 Mastzelle
K1 Allergie
PP Hohenheim
PB Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
UL http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2010/472