TY - THES T1 - Regulation von NIMIN- und PR1-Genen aus Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. und Nicotiana tabacum (L.) in der Salicylat-abhängigen Pathogenabwehr A1 - Hermann,Meike Y1 - 2010/02/17 N2 - Die systemisch aktivierte Resistenz (SAR) ist ein wichtiger Verteidigungsmechanismus der Pflanzen gegenüber Pathogenen. NPR1 übernimmt dabei die Rolle eines zentralen Regulators, der im Zusammenspiel mit TGA-Transkriptionsfaktoren die Salicylat (SA)-abhängige Ausbildung der SAR kontrolliert, die letztendlich zur Induktion von PR (pathogenesis-related) -Proteinen führt. Die SA-aktivierte Expression der PR1-Gene aus Arabidopsis thaliana (At) und Nicotiana tabacum (Nt) ist abhängig von as-1-ähnlichen cis-aktiven Elementen mit der Sequenz TGACG. In dieser Arbeit wurden neue Erkenntnisse zur funktionellen Bedeutung der NIMIN-Proteine und zur SA-abhängigen PR-Induktion gewonnen. In Arabidopsis gibt es 4 NIMIN-Gene - N1, N2, N3 und N1b, die unabhängig von TGA-Faktoren mit NPR1 interagieren. N1 und N2 besitzen ein gemeinsames Interaktionsmotiv und binden an den C-Terminus von AtNPR1, während N3 an den N-Terminus von AtNPR1 bindet. Relativ zentral in AtNPR1 liegt die Bindestelle für die TGA-Faktoren. Die Untersuchung der Expression der NIMIN-Gene im SAR-Signalweg sowie ihre mögliche Involvierung im Jasmonat (JA)-Signalnetzwerk sollte neue Hinweise zur Regulation der pflanzlichen Pathogenabwehr geben. Dabei wurde die Bedeutung von unterschiedlichen as-1-ähnlichen Elementen durch die Etablierung eines Hefe-Einhybridsystems analysiert. N1b ist vermutlich ein inaktives Pseudogen. Weder konnten in unbehandelten, SA- oder JA-behandelten Arabidopsis-Pflanzen Transkripte nachgewiesen werden noch war eine Konstruktion N1b[GUS] mit der 1135 Bp 5?-Region in der Lage, Reportergenexpression in transgenen Tabakpflanzen zu vermitteln. N3 wird in geringen Mengen konstitutiv und unabhängig von NPR1 exprimiert. Die Behandlung mit SA oder JA führt nicht zur Induktion von N3. Gleichermaßen lässt sich der N3-Promotor nicht durch die Behandlung mit SA, JA, TMV, H2O2 und Phytohormonen beeinflussen. Die Reportergenexpression des N3-Promotors erfolgt in Keimlingen transgener Tabakpflanzen konstitutiv. N1 und N2 sind dagegen eindeutig SA-induziert. Die Expression von N2 erfolgt nach einem SA-Stimulus unmittelbar und anhaltend und ist NPR1-unabhängig. N1 wird zu einem späteren Zeitpunkt transient exprimiert und ist dagegen NPR1-abhängig. Die Expression von N1 und N2 liegt dabei zeitlich klar vor der Expression des PR1-Gens. Die Analyse von GUS-Reportergenkonstruktionen bestätigt die zeitlich vorgezogene SA-abhängige Induktion des N1- und N2-Promotors vor der Aktivierung des NtPR1a-Promotors. Beide NIMIN-Promotoren lassen sich ? ähnlich dem NtPR1a-Promotor - außerdem durch Thiamin-HCl induzieren und zeigen bei gleichzeitiger Behandlung mit SA und JA einen reprimierenden Einfluss des JA-Signalnetzwerks auf die Stärke der Reportergenexpression. Auf histologischer Ebene zeigen der N1- und N2-Promotor eine SA-abhängige Aktivierung im Blatt- und Wurzelgewebe von jungen Tabakkeimlingen. Diese Aktivität unterscheidet sich klar vom N3-Promotor. Der N2-Promotor ? wie auch der AtPR1- und NtPR1a-Promotor ? besitzt ein as-1-ähnliches Element, das für die SA-Sensitivität des Promotors verantwortlich ist und das auf der Tandemwiederholung der Sequenz TGACG beruht Die Struktur des N2-as-1-ähnlichen Elements ist allerdings unterschiedlich zur Struktur der as-1-ähnlichen Elemente in den PR1-Promotoren. Im N1-Promotor konnte ein SA-responsives Element in der Region von -436 bis -402 bezogen auf den Translationsstart des N1-Gens lokalisiert werden. Die Mutation einer TGATG-Wiederholung in dieser Region ergab aber keinen Verlust der Promotoraktivität. Durch die Untersuchung chimärer Promotorkonstruktionen mit fremden as-1-ähnlichen Elementen konnte gezeigt werden, dass die unterschiedliche Kinetik der Expression von PR1- und NIMIN-Genen nicht durch die genetische Information der as-1-ähnlichen Elemente codiert wird. Im Gegensatz dazu üben die cis-aktiven Elemente eindeutig einen Einfluss auf die Gewebespezifität der Promotoren aus. Der NtPR1a-Promotor, der nach SA-Induktion lediglich im Blattgewebe aktiv ist, übernimmt durch den Einbau des N2-as-1-ähnlichen Elements die NIMIN-typische Aktivität im Wurzelgewebe SA-induzierter Keimlinge. Die Anwesenheit des 35S-as-1-Elements im NtPR1a-Promotor führt zur konstitutiven Aktivität in den Wurzelspitzen. Im Blattgewebe ist aber weiterhin eine SA-abhängige Aktivierung nachzuweisen.- Im Hefe-Einhybridsystem zeigen sich bei der Interaktion von TGA-Faktoren mit as-1 und den as-1-ähnlichen Elementen des AtPR1-, NtPR1a- und N2-Promotors bei der Qualität der Bindung nur geringe Unterschiede, während deutliche Differenzen bei der quantitativen Bindungsstärke auftreten. Die Mutation der as-1-ähnlichen Elemente im NtPR1a- und N2-Promotor führt dabei zum Verlust der Bindung. In der N1-Promotorregion von -436 bis -399 ist eine TGA-Bindestelle vorhanden. Die Einführung von Mutationen in die enthaltene TGATG-Wiederholung führt zum vollständigen Verlust der Bindung von TGA-Transkriptionsfaktoren. Der angrenzende Promotorkontext kann sowohl einen positiven als auch einen negativen Einfluss auf die Bindung der TGA-Faktoren ausüben. Im Fall des N1-Promotors führt die Anwesenheit der umgebenden Promotorregion zu einer verstärkten Bindungsaffinität. Im Gegensatz dazu zeigt der zusätzliche NtPR1a-Promotorkontext eine deutliche Reprimierung der Anlagerung von TGA-Faktoren an das as-1-ähnliche Element. NIMIN-Proteine und TGA-Faktoren konkurrieren im Hefe-Dreihybridsystem trotz unabhängiger Bindestellen um die Bindung an AtNPR1. Die Anwesenheit von N1 und N3 behindert dabei die Interaktion von TGA-Faktoren mit NPR1, während eine gleichzeitige Bindung von N2 und TGA-Faktor ohne Einschränkungen möglich ist. Eine Bindung von N1 bzw. N2 gleichzeitig mit N3 am C- und N-Terminus von NPR1 führt ebenfalls zu einer gegenseitigen Behinderung und lässt auf eine räumliche Faltung von AtNPR1 schließen, bei der sich N- und C-Terminus nahe kommen. KW - Ackerschmalwand KW - Tabak KW - Genanalyse CY - Hohenheim PB - Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim AD - Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart UR - http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2010/419 ER -