TY - THES T1 - Der Glucocorticoidrezeptor des Schweins: Herstellung und Charakterisierung eines polyklonalen Antiserums, sowie Studien zur Verteilung des GCR im Intestinaltrakt von Ebern und Kastraten A1 - Gutscher,Monika Y1 - 2003/11/11 N2 - Glucocorticoide sind entscheidend an der Regulation physiologischer Prozesse beteiligt. Auf zellulaerer Ebene spielen sie eine Schluesselrolle in der Regulation von Differenzierungs- und Apoptosevorgaengen. Diese Regulationsmechanismen sind vor allem in adaptiven Geweben, die sich in ihrer Funktion staendig an neue Anforderungen anpassen muessen, von enormer Bedeutung. Der Gastrointestinaltrakt ist eines der am staerksten beanspruchten Organe. Sowohl die Anpassung an veraenderte Nahrungsverhaeltnisse, als auch die staendige Belastung mit einer Vielzahl an Antigenen, erfordert eine genau abgestimmte Regulation der Zellteilung, Differenzierung und Apoptose. Bei Schweinen konnte gezeigt werden, dass Unterschiede in den Turnoverraten von Skelettmuskulatur und Darm den unterschiedlichen Glucocorticoidrezeptor (GCR) Konzentrationen zugeschrieben werden koennen. Dies erklaert zum Teil die gewebsspezifische Sensitivitaet auf zirkulierende Corticoide. Studien zur GCR-Verteilung im Intestinaltrakt tragen daher zum Verstaendnis der Regulationsmechanismen bei. Bislang waren Rezeptorstudien beim Schwein nur ueber Bindungsstudien moeglich. Nachteilig ist hierbei, dass in komplexen Gewebsstrukturen, wie z.B. dem Darm, die Rezeptoren nicht den verschiedenen Zelltypen zugeordnet werden koennen. Weiterhin ist ueber Bindungsstudien nur der Nachweis des nichtaktivierten Rezeptors moeglich. Daher war es das Ziel der Untersuchungen, Antiseren gegen den Glucocoridcoidrezeptor des Schweins zu erstellen. Teilarbeiten hierzu waren die Sequenzanalyse der cDNA des GCR und die Klonierung ausreichend grosser Fragmente in rekombinanten Expressionssystemen. Darauf aufbauend sollten speziesspezifische Antikoerper gegen Fragmente des Rezeptorproteins erzeugt werden. Dazu wurde ein Fragment mit ca. 2,1 kb der GCR cDNA (gcr2.1) sequenziert. Fuer die rekombinante Expression eines GCR-Antigens wurde ein Proteinfragement (135 AS) aus der modulatorischen Region (GCRmr) gewaehlt und als His-tag Fusionsprotein in ein T7-Expressionssystem kloniert. Nach affinitaetschromatographischer und praeparativer Aufreinigung des Fusionproteins ueber Ni-NTA-Agarose und SDS-PAGE wurden Kaninchen immunisiert. Das Anti-pGCR-Antiserum bindet mit hoher Affinitaet das pGCRmr Antigen sowie den denaturierten Rezeptor im Western Blot. Immunpraezipitationsversuche zeigten, dass das Antiserum den nativen Rezeptor in seiner inaktivierten Form als Multiproteinkomplex gekoppelt an HSP90, als auch in seiner aktivierten Form mit abgespaltenem HSP90 bindet. Die Resultate der Immunpraezipitation bestaetigen die Anwendbarkeit der Antikoerper in der Immunhistochemie. Praktische Anwendung fand das charakterisierte Antiserum in immunhistochemischen Studien zur Verteilung und Lokalisation des GCR im Duenn- und Dickdarm von Ebern und Kastraten. Die intrazellulaere Verteilung des GCR wurde mittels Western Blot Techniken untersucht. Bei Kastraten und Ebern kann in der Lamina propria ein Anstieg rezeptortragender Zellen von den proximalen Duenndarmbereichen Duodenum und Jejunum in Richtung Colon festgestellt werden. Die Immunfaerbung der Epithelzellen zeigt bei beiden Tiergruppen ein umgekehrtes Muster wie in der Lamina propria. Werden die beiden Gruppen - Eber und Kastraten - vergleichend betrachtet, zeigt sich, dass nur signifikante Unterschiede in der Anzahl GCR immunreaktiver Zellen in der Lamina propria zu beobachten sind. Im Duodenum sind bei Ebern etwa 10% weniger immunreaktive Zellen zu verzeichnen als bei Kastraten. Im Jejunum ist derselbe Effekt, allerdings wesentlich ausgepraegter, zu beobachten. Hier sind etwa 30% weniger immunreaktive Zellen. Im Dickdarm sind keine signifikanten Unterschiede festzustellen. UEber die intrazellulaere Rezeptorverteilung koennen folgenden Aussagen getroffen werden: in den einzelnen Darmabschnitten besteht zwischen Kastraten und Ebern sowohl in der Cytosol als auch in der Kernfraktion kein entscheidender Unterschied; im Ileum ist der Anteil des GCR im Cytosol kleiner als im Kern und im Colon ist der Anteil des GCR im Cytosol groesser als im Kern. Die unterschiedliche intrazellulaere GCR Lokalisation in den beiden Darmabschnitten kann durch die erhoehte Expression der 11beta-Hydroxysteroid-Dehydrogenase 2 im Colon erklaert werden. 11beta-HSD 2 inaktiviert Cortisol und unterbindet somit die Aktivierung und damit Translokation des Rezeptors in den Kern. KW - Glucocorticosteroide KW - Glucocorticosteroidrezeptor KW - Darm KW - Schwein CY - Hohenheim PB - Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim AD - Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart UR - http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2003/40 ER -