TY  - THES
T1  - Odorantrezeptoren in Axonen olfaktorischer Sinneszellen : in vitro Studien an Explantatkulturen
A1  - Luxenhofer,Georg
Y1  - 2009/01/15
N2  - Olfaktorische Sinnesneurone (OSN), die mit einem bestimmten Odorantrezeptor (OR) ausgestattet sind, liegen weit verstreut im olfaktorischen Epithel (OE) der Nase und senden ihr Axon in gemeinsame Glomeruli im olfaktorischen Bulb (OB). In einem räumlich hochkonservierten Muster werden dort rezeptorspezifisch synaptische Kontakte mit nachgeschalteten Projektions- und Interneuronen hergestellt. Über die molekularen Mechanismen, die dieser höchstpräzisen Verdrahtung zugrunde liegen ist trotz intensiver Forschung noch immer wenig bekannt. Im Hinblick auf eine Aufklärung der komplexen Prozesse ist ein geeignetes experimentelles System erforderlich, das eine gezielte Manipulation der auswachsenden Axone ermöglicht. In der hier vorliegenden Arbeit wurde daher zunächst ein in vitro System mit Gewebeexplantaten des olfaktorischen Systems etabliert. Die Verwendung transgener Mauslinien, in denen spezifische Sinneszellpopulationen inklusive aller zellulären Ausläufer durch intrinsische Fluoreszenz visualisierbar sind, erlaubte eine kontinuierliche Beobachtung distinkter Axonpopulationen unter definierten und manipulierbaren Bedingungen. Zellen in Explantaten des OE, die zum Zeitpunkt des Embryonalstadiums 14 (E14) in Kultur gebracht wurden, entwickelten nach wenigen Tagen zahlreiche axonale Ausläufer, die radiär und unfaszikuliert aus den Explantaten auswuchsen. Die Explantate enthielten nach kurzer Kultivierung hauptsächlich Vorläuferzellen von olfaktorischen Sinneszellen; nach einigen Tagen konnten bereits zahlreiche reife Sinneszellen mit robustem Axonwachstum nachgewiesen werden. Durch den Einsatz einer rezeptorspezifischen transgenen Mauslinie konnte weiterhin die Expression distinkter OR Gene in Subpopulationen von Sinneszellen sichtbar gemacht werden. Die Kulturbedingungen erlaubten also die Differenzierung von Vorläuferzellen zu typischen olfaktorischen Sinnesneuronen mit charakteristischer Genexpression.
Bezüglich der zentralen Frage zu Interaktionen zwischen olfaktorischen Axonen und ihrem Zielgewebe zeigten Kokultur-Experimente, dass ein Kontakt der Axone mit dem OB Gewebe zunächst eine repulsive Wirkung hatte. Erst eine Vorkultivierung des OB Gewebes resultierte in einer attraktiven Wirkung, wodurch die Axone sogar aus großen Entfernungen vom OB angezogen wurden. Die Anwesenheit des Bulbusgewebes hatte zudem einen positiven Einfluss auf die Wachstumsgeschwindigkeit der Axone. Dabei kam es zunächst zu einer starken Bündelung von Axonen, die in unmittelbarer Nähe des OB wieder in einzelne Fasern defaszikulierten. Diese Ergebnisse zeigten, dass mit dem in dieser Arbeit etablierten Explantatsystem charakteristische Parameter der Generierung olfaktorischer Sinneszellen, des Auswachsens von Axonen und der Interaktion der Axone mit ihrem Zielgewebe in vitro rekapituliert werden konnten. Somit wurden ideale Voraussetzungen dafür geschaffen, um zentrale Fragestellungen zu den molekularen Mechanismen zu bearbeiten, die der Etablierung der einzigartigen Verschaltung in diesem System zugrunde liegen. 
Die Explantatkulturen wurden im Folgenden dazu genutzt, die Rolle, die das olfaktorische Rezeptorprotein bei dem Prozess der olfaktorischen Wegfindung spielt, näher zu untersuchen. Durch Expression von genetisch modifizierten Varianten des Odorantrezeptors mOR256-17 in den Explataten konnten neue Einblicke in dessen subzelluläre Lokalisation gewonnen werden. Anhand eines mOR256-17-EGFP Fusionsproteins wurde ein vesikulärer Transport in die Dendriten der Sinneszellen sichtbar, welcher in einer Akkumulation des OR Proteins in den Cilien resultierte. Erstmals wurde mit dieser Technik das OR Protein in vesikulären Strukturen des Axons sichtbar, die anterograd und retrograd transportiert wurden. Der Rezeptor konnte in den Wachstumskegeln wachsender Axone und dort speziell in den Filopodien visualisiert werden. Mittels einer neuartigen Nachweismethode, mit der selektiv Proteine markiert werden können, die in der Plasmamembran lokalisiert sind, konnte ein retrograder Transport von internalisierten mOR256-17 Proteinen beobachtet werden. Die Generierung einer OR-Variante, bei der die Interaktionsdomäne des Rezeptors mit G-Proteinen mutiert wurde, resultierte in einer gestörten Verteilung des OR Proteins in den Sinneszellen. 
Insgesamt wurde mit dem in dieser Arbeit etablierten in vitro System ein entscheidendes Werkzeug geschaffen, mit dem bereits neue Einblicke in die Funktion distinkter molekularer Komponenten gewonnen wurde und dessen zukünftiger Einsatz zum weiteren Verständnis der komplexen Prozesse bei der Projektion olfaktorischer Sinneszellen beitragen kann.
KW  - Axon
KW  - In-vitro-Kultur
KW  - Geruch
CY  - Hohenheim
PB  - Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
AD  - Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart
UR  - http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2009/320
ER  -