RT Dissertation/Thesis T1 Identifizierung und Charakterisierung der Succinsemialdehyd-Dehydrogenase aus parasitischen und nichtparasitischen Arthropoden A1 Rothacker,Boris WP 2009/01/20 AB Ziel dieser Arbeit war es, die in Insektenmodellen weitgehend und in parasitischen Insekten und Akariden vollständig unerforschte SSADH molekularbiologisch und enzymologisch zu charakterisieren. Als Organismen der Wahl dienten das Bakterium Escherichia coli (Ec) und die Maus Mus musculus zu Referenzzwecken und für biophysikalische Untersuchungen des Enzyms, sowie Drosophila melanogaster (Dm) (Fruchtfliege), Lucilia cuprina (Lc) (Schafs-Schmeissfilege), Ctenocephalides felis (Cf) (Katzenfloh), und Rhipicephalus microplus (Rm) (Zecke) als Vertreter verschiedener Organismenklassen. Für Dm lag zunächst durch ?Expressed Sequence Tag?-Studien sowie der Entschlüsselung des Genoms ein Einzelgenkandidat vor, für den Homologiebetrachtungen nahe legten, dass es sich um das Fruchtfliegen-Genortholog für SSADH (DmSSADH) handeln könnte. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde dieser Genkandidat kloniert, und in Ec exprimiert. Zur vergleichenden Charakterisierung der enzymatischen Eigenschaften des SSADH-Expressionsprodukts wurde ein Genkandidat für eine Acetaldehyd-Dehydrogenase (DmALDH) aus Dm kloniert und in Ec exprimiert. Beide Produkte zeigten erwartete enzymatischen Eigenschaften: NAD+-abhängige Succinsemialdehyd-oxidierende (DmSSADH) und NAD+-abhängige Acetaldehyd-oxidierende Aktivität (DmALDH). Ein Vergleich der Substrateigenschaften von 30 Aldehyden und z.T. enzymkinetischen Parameter belegte die ausgeprägte Spezifität von DmSSADH für Succinsemialdehyd, während DmALDH als unspezifische Aldehyddehydrogenase eingeordnet wurde. Punktmutagenesestudien zeigten, dass zwei für die SSADH-Aktivität essentielle Aminosäuren Glutamat 277 und Cystein 311 sind. Im zweiten Teil der Arbeit erfolgte die Genidentifikation, Volllängen-Genklonierung, sowie die funktionelle Expression jeweils eines Genvertreters von SSADH aus Lc und Cf. Enzymkinetische Studien und Aktivitätsuntersuchungen der E. coli-exprimierten L. cuprina- (LcSSADH) und C. felis- (CfSSADH) Enzyme zeigten, dass beide vor allem NAD+-abhängige SSADHs sind. Analysen der LcSSADH und CfSSADH-Gene mittels PCR-und Southern-Blots zeigten, dass das SSADH-Gen in beiden Organismen nicht als Einzelkopie vorliegt, und dass die Exon-Intron-Struktur von Dm nicht konserviert ist. Die Funktionen der aufgedeckten multiplen Genkopien und die Gründe für die variablen Exon-Intron-Strukturen in den SSADH-Genen der hier betrachteten Spezies bleiben unklar. In Immunblot-Experimenten konnte schließlich gezeigt werden, dass SSADH in Imagines von Dm, Lc und Cf auch auf Proteinebene exprimiert ist. Der dritte Teil der Arbeit hatte die Genidentifizierung, sowie die biochemische Charakterisierung der SSADH aus der Zecke Rm zum Thema. Southern-Blot-Analysen zeigten, dass das SSADH-Gen im Rm-Genom wahrscheinlich in 2-3 Genkopien vorhanden ist. Für einen Vergleich der Zecken-SSADH mit dem Genprodukt eines Mammalier-Orthologen, wurde das SSADH-Gen aus der Maus isoliert und funktionell in Ec exprimiert. Der Vergleich der beiden Enzym ergab, dass beide potente NAD+-abhängige Succinsemialdehyd-oxidierende Aktivität besitzen und sehr ähnliche enzymkinetische Parameter aufweisen. Eine genauere vergleichende Betrachtung der Aktivität gegenüber verschiedenen Aldehydsubstraten zeigte deutliche Unterschiede zwischen den Enzymen beider Spezies. Generell scheint Maus-SSADH spezifischer für Succinsemialdehyd zu sein als Rm SSADH. Weiterhin ist das Mammalierenzym gegenüber den in dieser Studie identifizierten Inhibitoren p-Tolualdehyd und p-Methoxybenzaldehyd ebenso wie gegenüber Substratinhibition durch einen Überschuss Succinsemialdehyd weit weniger empfindlich als das Zeckenenzym. Es bleibt zu untersuchen, ob diese Unterschiede für die Auffindung potenter und spezifischer Inhibitoren nutzbar sind. Ebenso bleibt die Frage zu beantworten, ob SSADH, bzw. der GABA-Abbau allgemein eine valide akarizide Targetstruktur darstellt. Im vierten Abschnitt der Arbeit wurden drei im Rahmen dieser Arbeit hergestellte SSADH-Enzympräparate in Sättigungstransfer-Differenz-Kernresonanzspektroskopie-(STD-NMR-)Experimente eingesetzt, um Fragen zur Aldehydsubstrat- und Cosubstratbindung an SSADH zu beantworten. Es konnte eindeutig gezeigt werden, dass bei Ec und Dm SSADH das freie Aldehyd dem in wässriger Lösung für Succinsemialdehyd in gleicher Konzentration vorliegende geminale Diol (?gem-Diol?) als Substrat bevorzugt. Die STD-NMR-spektroskopische Untersuchung der Succinsemialdehyd-Interaktion mit der Dm SSADH C311A-Mutante zeigte die Bindung sowohl der Aldehyd- als auch der gem-Diol-Form. Dies deutet darauf hin, dass C311 für die Aldehyd-Selektivität des Enzyms entscheidend ist. Das STD-NMR-Epitopmapping der NAD+/NADP+-Bindung an E. coli-SSADH und an Dm SSADH legte in beiden Fällen die dominanten Protein-Interaktionen der Adenin- und Nikotinamidringe nahe, während die Ribose-Reste vermutlich weit weniger intensiv mit dem Enzym verbunden sind. K1 Aminobuttersäure K1 GABA-Rezeptor K1 Aminobutyrat-Transaminase <4-> K1 Lucilia cuprina K1 Katzenfloh K1 Boophilus microplus PP Hohenheim PB Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim UL http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2009/314