RT Dissertation/Thesis
T1 Molekulare und entwicklungsbiologische Charakterisierung von Schlüsselenzymen der Naturstoffbiosynthese in Drüsenhaaren der Sonnenblume
A1 Göpfert,Jens C.
WP 2008/10/30
AB In der vorliegenden Arbeit konnten durch Sequenzvergleiche mit bereits bekannten pflanzlichen Sesquiterpensynthasen drei in den Trichomen der Sonnenblume exprimierte Sesquiterpensynthasen identifiziert werden. Die Nuklein- und Aminosäuresequenzen wiesen für Terpensynthasen charakteristische Merkmale auf. Zur funktionellen Charakterisierung wurden alle identifizieren Terpensynthasen heterolog in E. coli exprimiert. Nach Aufreinigung und in vitro Umsetzungsreaktionen mit dem natürlichen Substrat Farnesylpyrophosphat wurden die Reaktionsprodukte durch GC-MS Messungen analysiert und die gebildeten Verbindungen anschließend anhand von Referenzproben bestimmt. Zwei der identifizierten Sesquiterpensynthasen (HaGAS1, HaGAS2) erwiesen sich als Germacren A-Synthasen und somit als die Schlüsselenzyme der Biosynthese der Sesquiterpenlactone der Sonnenblume. Die heterologe Expression der Germacren A-Synthasen in vivo in S. cerevisiae führte ebenfalls nur zur Bildung von Germacren A und war damit übereinstimmend mit den in vitro Daten.
Die funktionelle Charakterisierung der dritten Terpensynthase erwies ich aufgrund schwacher in vitro Aktivität als schwierig. Eine heterologe Expression in vivo in S. cerevisiae führte zu einer deutlichen Steigerung der erhaltenen Produktmengen. Doch erst die Expression als Thioredoxin-Fusionsprotein in Hefen ermöglichte die Bildung genügend hoher Produktmengen zur Identifizierung der gebildeten Verbindungen. Bei dieser Sesquiterpen-synthase (HaCS) handelt es sich um ein Multiproduktenzym, welches als eine von zwei Hauptkomponenten gamma-Cadinen bildet und als weitere Produkte alpha-Copaen, alpha-Muurolen und beta-Caryophyllen produziert.
In einer H. annuus Trichom EST-Bank wurde ein Cytochrom P450-Enzym identifiziert, das eine hohe Sequenzähnlichkeit zu einem bereits charakterisierten Gen aus Artemisia annua aufwies, welches an der Bildung von Artemisinin-Säure beteiligt ist. Die heterologe Expression dieses Enzyms und eines weiteren Proteins mit hoher Sequenzähnlichkeit aus Lactuca sativa zusammen mit der Germacren A-Synthase HaGAS2 in S. cerevisiae führte zur Bildung von Germacren A-Carboxylsäure und damit zur Aufklärung eines bisher nicht auf enzymatischer Ebene identifizierten Biosyntheseschrittes der Sesquiterpenlactone. Bei den identifizierten Enzymen aus H. annuus beziehungsweise L. sativa handelt es sich um multifunktionelle Germacren A-Monooxygenasen, die drei aufeinanderfolgende oxidative Schritte der Bildung von Germacren A-Carboxylsäure aus Germacren A katalysieren.
Semiquantitative RT-PCR Experimente konnten die Expression aller drei identifizierten Sesquiterpensynthasen, sowie der Monooxygenase der Sonnenblume, direkt in den Trichomen zeigen. Die Expression der Gene fand nur während der biosynthetisch aktiven Phase der Trichome statt und konnte in dieser Feinheit zum ersten Mal überhaupt gezeigt werden. Daneben wurden Transkripte der Sesquiterpensynthasen in trichomtragenden Blättern und im Wurzelbereich nachgewiesen. Neben Sesquiterpenlactonen wurden von den Drüsenhaaren auch Flavonoide gebildet, deren Biosynthese ebenfalls in den Trichomen angesiedelt ist. Mit 5-Deoxynevadensin konnte ein bisher unbekanntes und trichomspezifisches 5-deoxy-Flavon identifiziert werden.

K1 Biosynthese
K1 Sonnenblume
K1 Pflanzeninhaltsstoff
K1 Sekundärmetabolit
PP Hohenheim
PB Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
UL http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2008/305