TY  - THES
T1  - Lokalisation von Pheromon-Rezeptoren und -Bindeproteinen in antennalen Sensillen von Insekten
A1  - Gohl,Thomas
Y1  - 2008/02/13
N2  - Die bemerkenswerte Reaktivität von Motten auf spezifische Pheromone basiert auf einer extrem hohen Selektivität und Sensitivität der sensorischen Zellen in den Männchenantennen. Als Grundlage dafür wird eine Ausstattung der Zellen mit spezifischen Rezeptoren angesehen. Erst die Genom-Sequenzierung von Bombyx mori und Heliothis virescens hat eine Identifizierung von Kandidaten-Genen für olfaktorische Rezeptoren ermöglicht; dabei hat sich gezeigt, dass diese generell sehr heterogene Gruppe von Rezeptorgenen eine Subfamilie umfasst, die über Speziesgrenzen hinaus eine auffällige Sequenzhomologie aufweist. Eine konservierte Primärstruktur war für Pheromonrezeptoren postuliert worden. Im Hinblick auf eine Charakterisierung wurde im Rahmen dieser Arbeit mit verschiedenen experimentellen Ansätzen geprüft, ob diese Rezeptorkandidaten in Zellen der Pheromon-sensitiven Sensillenhaare (Sensilla trichodea) exprimiert werden. Mittels ?whole mount? in situ Hybridisierung wurde in den Antennen von Bombyx mori die RNA der Rezeptortypen BmOR1 bzw. BmOR3 in Zellen visualisiert, die unmittelbar benachbart positioniert sind und in ihrem Verteilungsmuster den trichoiden Sensillenhaaren entsprechen. Entsprechend konnte auch bei Heliothis virescens für einige Rezeptortypen dieser Gruppe (HR13, HR14, HR16) gezeigt werden, dass sie in Zellen exprimiert werden, die den Pheromon-sensitiven trichoiden Sensillenhaaren zugeordnet werden konnten. Neben den spezifischen Rezeptoren der Sinneszellen wird bei der Detektion von hydrophoben Pheromonmolekülen auch den Pheromonbindeproteinen (PBPs) eine wichtige Funktion zugeschrieben; PBPs werden in Glia-ähnlichen Zellen produziert, welche die Sinneszellen umgeben. In Doppel- in situ Hybridisierungsexperimenten konnte gezeigt werden, dass z.B. die HR13-Zellen in der Tat von HvirPBP1- und HvirPBP2-exprimierenden Zellen umgeben sind. Vergleichende Untersuchungen zur Topologie verschiedener Rezeptortypen haben gezeigt, dass HR13-Zellen dem trichoiden Sensillen-Typ A zuzuordnen sind, während HR14 und HR16 in Zellen des Sensillen-Typs C exprimiert werden.  Diese charakteristischen topologischen Expressions-muster sind als weiterer Hinweis zu werten, dass es sich bei den Rezeptorkandidaten tatsächlich um Rezeptoren für Pheromone handeln dürfte. Die Zuordnung individueller Rezeptortypen zu distinkten Sensillen-Typen eröffnet neue Ansätze für die Ermittlung der funktionellen Implikationen von Rezeptortypen für die Registrierung von Haupt- und Nebenkomponenten komplexer Pheromon-Gemische. Im Verlauf einer weiteren Charakterisierung von Rezeptor-exprimierenden Zellen hat sich gezeigt, dass nur der Rezeptortyp HR13 eine Coexpression mit einem ?Markerprotein? für sensorische Neurone, dem SNMP1 (Sensory Neuron Membrane Protein 1) aufwies, nicht jedoch die beiden Rezeptortypen HR14 und HR16. Zur Überprüfung der These ob u. U. ein weiterer SNMP-Subtyp existiert, wurden Screeningverfahren durchgeführt und dabei tatsächlich ein neuer SNMP-Typ (SNMP2) von Heliothis virescens identifiziert. Untersuchungen zur Expression haben gezeigt, dass die topologische Verteilung der SNMP2-Zellen zwar mit der von SNMP1-Zellen vergleichbar ist, dass sie jedoch eine sehr unterschiedliche Morphologie aufweisen. Weiterführende Untersuchungen haben dann gezeigt, dass SNMP2 in den PBP-produzierenden Hüllzellen der trichoiden Sensillenhaare exprimiert wird. Diese Befunde stellen die SNMP-Proteine in einen neuen Kontext und eröffnen neue Spekulationen über deren mögliche Funktionen.  
Ein wichtiges Ziel dieser Arbeit war der Versuch, die Rezeptor-relevanten Zellen nicht nur mittels mRNA-Visualisierung zu identifizieren, sondern die eigentlichen Rezeptorproteine immunhistochemisch zu erfassen. Obwohl sich die Generierung von Antikörpern für olfaktorische Rezeptoren als extrem schwierig erwiesen hat, ist es gelungen, für den Rezeptortyp HR13-spezifische Antikörper zu gewinnen. Mit Hilfe dieser Antikörper war es dann erstmals möglich, immunhistochemische Untersuchungen zur Lokalisation des Rezeptorproteins HR13 durchzuführen. In Doppelmarkierungsstudien mit einer HR13 antisense RNA-Sonde und den HR13-spezifischen Antikörpern konnte die Colokalisation von mRNA und Protein in den entsprechenden Zellen nachgewiesen werden. Darüber hinaus war es mit konfokaler Laserscanningmikroskopie möglich, die Verteilung des Rezeptorproteins in den verschiedenen Kompartimenten, insbesondere auch in den sensorischen Dendriten, zu visualisieren. Außerdem hat sich gezeigt, dass Rezeptorproteine auch in den axonalen Fortsätzen der sensorischen Zellen vorkommen. Durch Rezeptor-spezifische Markierungen wurde deutlich, dass die Axone mit HR13-Rezeptoren im antennalen Nerv als Bündel organisiert sind. Im Antennen-Nerv konnten HR13-markierte Axone bis zum Eintritt in die ?sorting zone? des antennalen Lobus visualisiert werden; im Unterschied zu den Befunden bei der Maus, war eine Markierung in den entsprechenden Glomeruli nicht nachweisbar. 

KW  - Biologie
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KW  - Bindeproteine
CY  - Hohenheim
PB  - Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
AD  - Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart
UR  - http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2008/223
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