RT Dissertation/Thesis
T1 Detektion von Schadhefen in Wein mittels mit Flusszytometrie analysierter in situ Hybridisierung (Flow-FISH)
A1 Willberger,Ilka Nadine
WP 2022/05/10
AB In der önologischen Praxis werden meist unpasteurisierte Moste verwendet. Dadurch kommt es zu einem vermehrten Eintrag von Nicht-Saccharomyceten, welche den Fermentationsprozess nachhaltig beeinflussen können. Störungen im Fermentationsprozess werden im Praxisbetrieb zumeist nur anhand von Auffälligkeiten ausgewählter Parameter wie Zuckergehalt oder Temperatur oder dem Auftreten von Fehltönen detektiert. Die fermentierende Hefepopulation kann zu diesem Zeitpunkt bereits so geschädigt sein, dass ein Eingreifen in die Fermentation das Auftreten von Fehltönen im Endprodukt oder eine unvollständige Fermentation nicht mehr verhindern kann. Mit Hilfe der Flusszytometrie wurde eine effiziente Methode entwickelt, um die gängigen Vertreter der Fermentationspopulation wie Saccharomyces cerevisiae und der Schadhefenpopulation wie Hanseniaspora uvarum, Dekkera bruxellensis und Pichia anomala im Fermentationsverlauf mittels FISH (Fluoreszenz in situ Hybridisierung) zu detektieren und quantitativ zu erfassen. Durch eine rasche Detektion können rechtzeitig Gegenmaßnahmen ergriffen werden, bevor eine Schadhefenpopulation zu großen Einfluss auf den Fermentationsverlauf und die gebildeten Stoffwechselmetabolite nehmen kann. 
Die Etablierung der Flow-FISH wurde in definiertem Medium (YPD) und pasteurisiertem weißen Traubenmost mit Reinkulturen durchgeführt. Die Probenentnahme und Fixierung erfolgt direkt aus Fermentationsansätzen. Zur Hybridisierung werden 18S- und 26S-rRNA-Sonden mit FITC-Markierung eingesetzt. Für die Auswertung der flusszytometrischen Daten wird in dieser Arbeit die Methode der Overton-Subtraktion angewendet. Diese ermöglicht eine genauere Beurteilung der hybridisierten Zellpopulation als das übliche Setzen eines Markers. Dazu wird eine effektive Negativkontrolle mit komplementärer Sequenz zu der universellen Eukaryontensonde (Euk516) eingeführt. Anschließend erfolgte die Optimierung der bereits aus der Literatur bekannten Methode hinsichtlich Hybridisierungsbedingungen und Zellfixierung und somit ihre Anpassung an die Anforderungen einer quantitativen flusszytometrischen Analyse. Mit der Fixierung in Formaldehyd oder in Ethanol wurden Fixiermethoden entwickelt, die die Ansprüche an sowohl eine schnelle und zuverlässige Fixierung im Labor, als auch an eine rasche Fixierung im Keller, erfüllen. Zur Erhöhung der Fluoreszenzintensität wurden Hilfssonden entworfen. Diese sind unmarkiert und binden in direkter Nachbarschaft der spezifischen Sonde. Bei allen untersuchten Hefespezies S. cerevisiae, H. uvarum, D. bruxellensis und P. anomala kann durch den Einsatz der Hilfssonden die Fluoreszenzintensität deutlich gesteigert werden. Bei D. bruxellensis und P. anomala ist erst durch den Einsatz der Hilfssonden ein Nachweis möglich. Durch die Hilfssonden kann der Flow-FISH-Assay in einem breiteren Wachstumsbereich der Hefekultur eingesetzt werden. Ohne Hilfssonden ist die quantitative Detektion auf die mittlere logarithmische Wachstumsphase beschränkt. Mit Hilfssonden können schon in der frühen logarithmischen Wachstumsphase bis in die stationäre Phase hinein hybridisierte Zellen zuverlässig detektiert werden. Damit wird die kritische Phase der fermentativen Aktivität abgedeckt, um so zunehmende Kontaminationen in der Fermentation erkennen zu können. Die Spezifizität der Sonden ist gegeben. Zum Teil kommt es zu leicht erhöhten Fluoreszenzintensitäten gegenüber der Negativkontrolle vor allem mit der D. bruxellensis-Sondenkombination und dafür unspezifischen Hefen, die wahrscheinlich auf vermehrte Bindungen auf Grund der Zusammenstellung dieser Sondenkombination zurückzuführen sind.Der Flow-FISH-Assay ist auch in Mischungen verschiedener Hefespezies und bis zu einer Zellzahl von 10³ Zellen/  ml in der Ausgangsfermentation zuverlässig. Dieses Detektionslimit wird auch von anderen molekularbiologischen Methoden zur Hefedetektion erreicht. Im Gegensatz zu den meisten dieser Methoden kann die Flow-FISH auch die Anzahl der vorhandenen Hefen quantifizieren. Der Einsatz des Flusszytometers ermöglicht zusätzlich eine einfache Variante die Gesamtzellzahl aller Hefen in der Fermentation zu ermitteln. Das Detektionslimit der Flow-FISH ermöglicht eine Detektion bevor die Schadschwellenwerte der untersuchten Hefen erreicht sind.
Die in dieser Arbeit vorgestellte Flow-FISH-Methode ist auch bei anderen Hefestämmen, die teilweise auch aus Wildisolaten stammen, anwendbar. Eine Übertragbarkeit auf native Fermentationen aus der önologischen Praxis ist gegeben. Es gelang sowohl Spontanfermentationen als auch inokulierte Fermentationen in Praxisgärungen im Stahltank auf ihre Hefepopulationszusammensetzung hin zu untersuchen und ihre Entwicklung im Laufe der Fermentation zu verfolgen.Der optimierte Flow-FISH-Assay bietet durch den Einsatz der Flusszytometrie und der in dieser Arbeit verwendeten Hilfssonden und Negativkontrolle eine stabile Basis zur weiteren Entwicklung eines Testsystems für den Einsatz in der önologischen Praxis.
K1 Wein
K1 Most
K1 Hefeartige Pilze
K1 Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung
K1 Önologie
K1 Lebensmittelmikrobiologie
K1 Saccharomyces cerevisiae 
PP Hohenheim
PB Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
UL http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2022/2019