RT Dissertation/Thesis T1 Funktionelle Charakterisierung von 9-O-Acetylesterasen enterohämorrhagischer Escherichia coli A1 Feuerbaum,Stefanie WP 2019/11/18 AB Enterohämorrhagische Escherichia coli (EHEC) können während einer Infektion den menschlichen Dickdarm kolonisieren und konkurrieren mit kommensalen E. coli und anderen Darmbakterien um limitierte Nährstoffe. Gobletzellen des Dickdarms produzieren das Glykoprotein Muzin, wodurch eine mukosale Barriere entsteht, die kommensale Bakterien nicht durchbrechen können. Das am häufigsten vorkommende Glykoprotein im Mukus des Dickdarms ist Muzin 2 (MUC2). Dieses stark O-glykosylierte Protein enthält in seiner Glykanstruktur endständig Neuraminsäuren, welche an bis zu 4 C-Atomen O-Acetylierungen aufweisen können. Eine O-Acetylierung inhibiert die Aktivität von Glykosidasen, wodurch das Glykoprotein nicht degradiert werden kann. Viele apathogene und pathogene E. coli tragen chromosomal ein nanS Gen, welches für eine 9-O-Acetylesterase kodiert. NanS ist für den Neuraminsäurestoffwechsel von Neu5,9Ac2 notwendig. Durch die de-O-Acetylierung entstehen Neu5Ac und Acetat. Beide Verbindungen können als Energiequellen genutzt werden. Die beiden in dieser Arbeit verwendeten EHEC O157:H7 Stamm EDL933 und O104:H4 Stamm C227-11Φcu kodieren für weitere 9-O-Acetylesterasen, deren Gene sich auf Prophagen befinden. In der vorliegenden Arbeit wurden die enzymatischen Funktionen der Prophagen-kodierten 9-O-Acetylesterasen bezogen auf den Kohlenhydratmetabolismus und während der Infektion in vitro weiter charakterisiert. Da Neu5Ac nicht nur am C9, sondern auch an C4, C7 und C8 O-acetyliert sein kann, wurde mittels HPTLC und nanoESI MS Analysen das Substratspektrum rekombinant exprimierter NanS-p analysiert. Die Ergebnisse zeigten eine de-O-Acetylierung von bis zu dreifach O-acetylierten Neuraminsäuren aus Rinderdrüsenspeichelmuzin. Während an C4 keine de-O-Acetylierung stattfand, konnten O-Acetylgruppen an C7, C8 und C9 abgespalten werden. Diese enzymatische Aktivität fand auch bei Glykan-gebundenen Neuraminsäuren statt, wodurch diese zugänglich für Sialidasen wurden. Weitere Analysen zeigten einen NanS-p abhängigen Abbau von Muzin im Zellkulturversuch. Hierfür wurde die humane Epithelzelllinie LS 180 verwendet. Während der Wildtyp O157:H7 EDL933 das Muzin nach vierstündiger Infektion fast vollständig abbauen konnte, war die Deletionsmutante EDL933ΔnanSΔnanS-p1-nanS-p7 nicht fähig, die Muzinschicht zu degradieren. Die Mutante EDL933ΔnanSΔnanS-p1-nanS-p5 konnte während der Infektion lediglich einen geringen Anteil des Muzins abbauen. Da 9-O-Acetylesterasen anderer Organismen die Adhärenz an Epithelzellen vermitteln, wurde auch in der vorliegenden Arbeit überprüft, inwiefern NanS-p in vitro das Anheften von EHEC an Darmepithelzellen beeinflussen. Die Ergebnisse der durchgeführten Adhärenzassays mit HT-29 Zellen bestätigen den Einfluss von NanS-p auf die Adhärenz von O157:H7 EDL933 und O104:H4 C227-11Φcu an die Darmepithelzellen. Nach einstündiger Infektion adhärierten Deletionsmutanten EDL933ΔnanSΔnanS-p1-nanS-p7 und C227-11ΦcuΔnanS-p11-nanS-p14 signifikant weniger als die Stämme O157:H7 EDL933 und O104:H4 C227-11Φcu. Während die Deletionsmutante O157:H7 EDL933ΔnanSΔnanS-p1-nanS-p5 gleiches Adhärenzverhalten wie der Wildtyp aufweist, zeigt die Mutante C227-11ΦcuΔnanS-p11-nanS-p12 im durchgeführten Assay eine verringerte Adhärenz an Epithelzellen als der Wildtyp O104:H4 C227-11Φcu. Hier wurde erneut der Gendosiseffekt sichtbar. Durch die Zugabe von rekombinant exprimiertem und aufgereinigtem NanS-p1-His zur Infektion konnte die Deletionsmutante EDL933ΔnanSΔnanS-p1-nanS-p7 das Adhärenzverhalten des Wildtypes O157:H7 EDL933 erreichen. Wurde zur Infektion mit C227-11ΦcuΔnanS-p11-nanS-p14 NanS-p15-His zugegeben, wurden im Vergleich zum Wildtyp O104:H4 C227-11Φcu signifikant mehr adhärente Bakterien detektiert. Weitere Analysen zeigten zudem einen Einfluss der NanS-p auf die Motilität. Stämme O157:H7 EDL933 und O104:H4 C227-11Φcu weisen im Schwimmversuch durch das Vorhandensein kleiner Mengen an Neuraminsäuren eine verringerte Motilität auf. Alle verwendeten Deletionsmutanten EDL933ΔnanSΔnanS-p1-nanS-p5, EDL933ΔnanSΔnanS-p1-nanS-p7, C227-11ΦcuΔnanS-p11-nanS-p12 und C227-11ΦcuΔnanS-p11-nanS-p14 zeigten ein erhöhtes Schwimmverhalten im Vergleich zu wildtypischen Stämmen O157:H7 EDL933 bzw. O104:H4 C227-11Φcu. Durch die Zugabe von 80 mM Acetat zu Schwimmplatten zeigten die Deletionsmutanten EDL933ΔnanSΔnanS-p1-nanS-p7 und C227-11ΦcuΔnanS-p11-nanS-p14 eine verringerte Motilität. Durch die enzymatische Aktivität der O-Acetylesterasen entstehen Neu5Ac und Acetat. Beide Verbindungen können Genexpressionen in Bakterien beeinflussen und somit die Nischen-Kolonisierung unterstützen. Zusammengefasst bestätigen die Ergebnisse, dass O-Acetylesterasen aus EHEC eine wichtige Funktion während der Infektion aufweisen, indem sie die Motilität beeinflussen, notwendig zum Durchbrechen der mukosalen Barriere sind und dem Bakterium am Darmepithel die Adhärenz vermitteln. K1 EHEC K1 Esterasen K1 Mucine K1 Muzin K1 NanS K1 NanS-p PP Hohenheim PB Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim UL http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2019/1670