RT Dissertation/Thesis
T1 Molekularbiologische und physiologische Untersuchungen zur Bedeutung phagenkodierter Sialinsäureesterasen von enterohämorrhagischen Escherichia coli (EHEC)
A1 Saile,Nadja
WP 2019/08/13
AB Enterohämorrhagische Escherichia coli (EHEC) können im Menschen Komplikationen wie hämorrhagische Colitis oder das lebensbedrohliche hämolytisch urämische Syndrom auslösen. Ihre Hauptvirulenzfaktoren sind Shiga Toxine (Stx) und ein Typ-III-Sekretionsystem. Zur Kolonisation des Dickdarms stehen EHEC mit der Darmmikrobiota im Wettbewerb um limitierte Energiequellen wie die Sialinsäure 5-N-Acetylneuraminsäure (Neu5Ac). Für den Neu5Ac-Katabolismus besitzen E. coli die Gene nanA, nanT, nanE, nanK, nagA und nagB. Sialinsäuren kommen endständig an Muzinen des Mukus im Dickdarm vor. E. coli bilden keine Sialidasen, die zur Freisetzung von Neu5Ac aus Muzin nötig sind. Jedoch kann gebundenes Neu5Ac durch Sialidasen von anaeroben Bakterien im Darm abgespalten werden und sind dann verfügbar. Viele E. coli Stämme exprimieren das nanCMS Operon. NanC ist ein Porinprotein, NanM ist eine Mutarotase und NanS ist eine O-Acetyl Esterase. NanS konvertiert 5-N-Acetyl-9-O-Acetylneuraminsäure (Neu5,9Ac2) und Neu5,8Ac2 zu Neu5Ac und ist maßgeblich an der Energiegewinnung aus diesen Substraten beteiligt. In Prophagen von EHEC und anderer pathogener E. coli kommen multiple nanS-homologe offene Leserahmen vor, die in dieser Arbeit als nanS-p (p = Phage) deklariert wurden. In dieser Dissertation sollte die Frage geklärt werden, warum EHEC multiple nanS-p Gene besitzen und ob die entsprechenden Proteine zur Energiegewinnung und zu einem Wettbewerbsvorteil für EHEC Bakterien beitragen. Außerdem sollte die Beteiligung der Sialidase BTSA von Bacteroides thetaiotaomicron an der NanS-p abhängigen Verwertung von Muzin untersucht werden.
Für die Analysen wurde der pathogene E. coli O157:H7 Stamm EDL933 sowie die pathogenen O104:H4 Stämme LB226692 und C227-11phicu (Variante von C227-11, die keinen stx-Prophagen besitzt) und die apathogenen Stämme AMC 198 (nanS+, nanS-p-) und C600deltananS (nanS-, nanS-p-) verwendet. Die Chromo-somensequenzen von EDL933 und LB226692 wurden in silico analysiert. NanS-p2 und NanS-p4 aus EDL933 wurden rekombinant hergestellt und das pH- und das Temperaturoptimum, sowie potenzielle Substrate analysiert. nanS/nanS-p Deletionsmutanten von EDL933 und C227-11phicu wurden konstruiert und mit Neu5,9Ac2 oder Muzin kultiviert. Dabei wurden die Verläufe der Wachstumskurven durch Trübungsmessung oder Lebendkeimzahlbestimmung analysiert. In Co-Kultivierungsversuchen wurden dem Medium der Stamm AMC 198 und/oder BTSA und/oder NanS-p zugesetzt.
Das Chromosom von EDL933 enthält das chromosomale nanS und sieben nanS-p Gene, während in LB226692 kein nanS, aber fünf nanS-p Gene vorkommen. Es konnte bestätigt werden, dass alle nanS-p Gene in der spät regulierten Region von Prophagen lokalisiert sind. Die putativen NanS-p Proteine tragen die Domänen 303, die für die Esterasefunktion in NanS bekannt ist, und die unbekannte Domäne 1737. Die untersuchten rekombinanten NanS-p Proteine de-O-acetylierten die Substrate Neu5,9Ac2 und Rinderspeicheldrüsenmuzin und zeigten ein Temperatur- und pH-Optimum von 40-50 °C bzw. 7-9. Die Generationszeiten der Deletionsmutanten stiegen mit der Anzahl der deletierten nanS-p Gene im Chromosom und somit konnte ein Gen-Dosis-Effekt nachgewiesen werden. Durch extrazelluläre Supplementierung mit NanS-p konnte die ursprüngliche Wachstumskinetik des Wildtyps wiederhergestellt werden. Die einzelne Deletion von nanS im EDL933 Chromosom (EDL933deltananS) änderte die Wachstumskinetik des Stammes mit Neu5,9Ac2 nicht. NanS ist für eine Vermehrung von EDL933 mit Neu5,9Ac2 also nicht notwendig. C600deltananS, konnte Neu5,9Ac2, wie erwartet, nicht katabolisieren. Den ursprünglichen Verlauf der Wachstumskurven einer C600 Kultivierung zeigte C600deltananS jedoch durch NanS-p Zusatz im Medium. In einem Co-Kultivierungsexperiment stieg die Lebendkeimzahl von C227-11phicu an, während sich AMC 198 kaum vermehrte. Erst nachdem alle nanS-p Gene im C227-11phicu Chromosom deletiert waren, stieg die Lebendkeimzahl von AMC 198. In Muzin-haltigem Medium mit BTSA als Zusatz, konnte sich EDL933 und EDL933deltananS, nicht aber EDL933deltananSdeltananS-p1a-p7, vermehren. Dies zeigte, dass die Kombination aus BTSA und NanS-p das Wachstum von EDL933 in einer Muzinhaltigen Umgebung unterstützt.
Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigten zum ersten Mal die wichtige Bedeutung der Prophagen-kodierten O-Acetyl Esterasen für EHEC Bakterien und sind eine hervorragende Basis für weitere Arbeiten, die zu einem tieferen wissenschaftlichen Verständnis des Sialinsäurekatabolismus in EHEC und anderen pathogenen E. coli beitragen können. Sie identifizieren Sialinsäuren als Substrate einer potenzielle Nährstoffnische im Darm und eröffnen ein mögliches Ziel für therapeutische Ansätze.

K1 EHEC, Acylneuraminsäuren, Mucine, Esterasen
K1 Sialinsäuren
K1 Muzin
K1 Esterase
K1 nanS
PP Hohenheim
PB Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
UL http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2019/1632