TY  - THES
T1  - Entwicklung von ?screening?-Methoden zur Analyse von PTGS-basierter Resistenz gegen Nepoviren in Pflanzen
A1  - Winterhagen,Patrick
Y1  - 2006/11/29
N2  - Die durch Nepoviren verursachte Reisigkrankheit führt zu beträchtlichen Einbußen im Weinbau (Raski et al., 1983). Um Resistenz durch ?post transcriptional gene silencing? (PTGS) gegen die Nepoviren Grapevine fanleaf virus (GFLV), Arabis mosaic virus (ArMV) und Raspberry ringspot virus (RpRSV) zu induzieren, wurden Reben mit ?inverted repeat?-Konstrukten bzw. mit Konstrukten transformiert, die ?defective interfering?-Sequenzen aus Tomato bushy stunt virus (TBSV) in Kombination mit konservierten viralen Sequenzen des Zielviruses enthielten (Reustle et al., 2005). Die Induktion und Effizienz von PTGS durch die verschiedenen Konstrukte wurde an der Modellpflanze Nicotiana benthamiana untersucht. PTGS konnte über die Akkumulation von transgenspezifischer ?small interfering? (si)RNA in N. benthamiana nachgewiesen werden. Durch Agrobakterien-Infiltration eines GFP-Sensorkonstrukts wurde die Effizienz von etabliertem PTGS in transgenen N. benthamiana  überprüft. GFP-exprimierende Pflanzen akkumulierten in den infiltrierten Blättern am ersten Tag nach der Infiltration mRNA des Infiltrats. Ab dem zweiten Tag nach der Infiltration wurde siRNA mit GFP- und virusspezifischer Sequenz detektiert. In Pflanzen, die keine GFP-Fluoreszenz zeigten, war weder mRNA, noch siRNA des infiltrierten Sensorkonstrukts nachweisbar. Bei virusresistenten Pflanzen konnte in der Regel keine GFP-Fluoreszenz nach der Agrobakterien-Infiltration festgestellt werden. Eine Korrelation von Virusresistenz mit der Akkumulation von viraler oder transgenspezifischer siRNA lag nicht vor. Verschiedene Systeme zur Evaluierung von PTGS und Virusresistenz in Reben wurden überprüft. Eine Akkumulation von siRNA, die auf transgen-induziertes PTGS hinweist, konnte bei Reben nicht festgestellt werden. Durch Virusinokulation mittels Pfropfung der transgenen Reben auf virusinfizierte Unterlagen konnte zumindest eine verminderte Virusanfälligkeit einer transgenen Linie festgestellt werden. Virusinfizierte transgene Reben und nicht-transgene Kontrollreben akkumulierten sowohl virale RNA, als auch siRNA. In transgenen Reben, die keine Virusinfektion zeigten, war weder virale RNA, noch siRNA zu detektieren. Eine etablierte Virusresistenz durch transgen-induziertes PTGS in transgenen N. benthamiana korrelierte nicht mit der Akkumulation von siRNA. Resistenzanalysen über Inokulation durch Pfropfung sind schwierig zu interpretieren, da durch den hohen Infektionsdruck eine eventuell vorhandene Feldresistenz nicht festgestellt werden kann. Um PTGS  an Rebenblättern in vivo zu überprüfen, wurde  eine Methode zur Agrobakterien-Infiltration durch Vakuum etabliert. Zur Virusinokulation durch Vektornematoden von Reben stehen sehr aufwändige und langwierige Freiland- bzw. Gewächshausversuche zur Verfügung. Eine in vitro Dualkultur wurde zur Inokulation mit Xiphinema index, dem natürlichen Vektor für GFLV, entwickelt. Mit diesem Inokulationssystem ist es möglich, die Resistenz von Reben unter kontrollierten Bedingungen auf kleinem Raum innerhalb kurzer Zeit zu testen. Bei Kontrollreben wurde eine Virusinfektion schon nach sechs Wochen Inkubationszeit nachgewiesen.
KW  - Geninaktivierung
CY  - Hohenheim
PB  - Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
AD  - Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart
UR  - http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2006/160
ER  -