RT Dissertation/Thesis
T1 Funktionelle Bedeutung unterschiedlicher NPR-Proteine für die Salicylsäure-abhängige Genexpression im Rahmen der systemisch aktivierten Resistenz in Arabidopsis thaliana und Nicotiana tabacum
A1 Konopka,Evelyn Maria Anna Hedwig
WP 2018/12/03
AB Ein wichtiger Schutzmechanismus der Pflanze gegen biotrophe Pathogene ist die systemisch aktivierte Resistenz (SAR). Die Akkumulation von PR-Proteinen in distalem, unifizierten Blattgewebe ist ein Hauptmerkmal der SAR. Die Expression von PR1-Genen in Tabak (Nt) und Arabidopsis (At) wird durch Salicylsäure (SA) induziert. NPR1 ist das zentrale Regulatorprotein der SAR. Im Zusammenspiel mit NIMIN-Proteinen und TGA-Transkriptionsfaktoren wird die Induktion der PR1-Genexpression SA-abhängig durch NPR1 kontrolliert. NIMIN-Proteine wirken als negative Regulatoren auf die PR1-Genexpression, während TGA-Transkriptionsfaktoren die Bindung an SA-responsive cis-aktive as1-ähnliche Elemente der PR1-Promotoren vermitteln. Die Wahrnehmung von SA erfolgt im C-Terminus von NPR1. Dort findet die SA-sensitive Bindung von NIMIN1 (N1) und NIMIN2 (N2) über die N1/2-Bindedomäne statt und das Arginin im konservierten LENRV-Motiv ist maßgeblich an der Wahrnehmung der SA beteiligt. Die Mutation des Arginins führt in At und Nt NPR1 zur Aufhebung der SA-Sensitivität der NIMIN-Bindung. Arabidopsis weist noch drei weitere Mitglieder der NPR-Proteinfamilie mit derselben Domänenstruktur wie NPR1 auf: AtNPR2, AtNPR3 und AtNPR4. In Tabak gibt es nur NtNPR1 und NtNPR3. Für AtNPR3, AtNPR4 und NtNPR3 sind auch SA-abhängige Reaktionen in Hefe bekannt. Während die Bindung von N2-Proteinen an den C-Terminus von NtNPR3 negativ durch SA beeinflusst wird, reagiert der C-Terminus von AtNPR3 und AtNPR4 mit einer strukturellen Umlagerung auf SA. Die C-terminalen Domänen LENRV-ähnliche-Domäne und N1/2-Bindedomäne besitzen eine SA-induzierte Affinität zueinander. Ziel dieser Arbeit war es, neue Erkenntnisse über die Funktion von NPR1 und seine Homologen und Paralogen in Arabidopsis und Tabak bei der SA-abhängigen Genexpression, beim Mechanismus der SA-Wahrnehmung sowie der Signaltransduktion zu gewinnen. Für die Analyse der biochemischen Eigenschaften der At und Nt NPR-Proteine fand das heterologe Hefesystem Anwendung. Die Bedeutung der NtNPR-Proteine in planta wurde anhand von CRISPR/Cas9 erzeugten Mutanten analysiert. Folgende Ergebnisse wurden erzielt:
1.Für AtNPR2 konnte auch eine SA-abhängige Reaktion gezeigt werden. Die spontane Interaktion mit TGA-Transkriptionsfaktoren der Klassen II und III wird durch SA signifikant verstärkt.
2.Das Arginin im LENRV-ähnlichen Motiv der At und Nt NPR-Proteine ist maßgeblich an der Wahrnehmung von SA beteiligt. Die Mutation des Arginins unterbindet die SA-abhängigen Reaktionen der At und Nt NPR-Proteine völlig, ohne dabei weitere biochemische Eigenschaften der Proteine zu verändern.
3.Die SA-abhängigen Reaktionen der untersuchten At und Nt NPR-Proteine sind auch durch strukturelle Analoga der SA induzierbar. Besonders potent erwiesen sich die dichlorierten Verbindungen 3,5-Dichloranthranilsäure (3,5-DCA) und 3,5-Dichlorbenzoesäure, aber auch BTH und INA, bekannte Induktoren der PR1-Genexpression, zeigten eine direkte Wirkung auf NPR-Proteine. AtNPR4 ist allerdings sehr spezifisch für SA. Anhand von IC50 bzw. EC50-Werten konnte gezeigt werden, dass Nt NPR-Proteine sensitiver auf SA reagieren als At NPR-Proteine und 3,5-DCA wirksamer als SA ist.
4.AtNPR2, AtNPR3 und AtNPR4 können vergleichbar stark wie AtNPR1 mit TGA-Transkriptionsfaktoren der Klassen II und III in Interaktion treten. Trotz konservierter N1/2-Bindedomäne im C-Terminus können die Paraloge nicht Mitgliedern der NIMIN-Proteinfamilie binden. Die Bindung von NIMIN-Proteinen und die Bildung ternärer Komplexe mit NIMIN-Proteinen und TGA-Transkriptionsfaktoren ist einzigartig für AtNPR1.
5.Chimäre Interaktionen zeigten, dass die LENRV-Domäne im Fall von NtNPR3 entscheidend dafür ist, dass eine SA-abhängige strukturelle Umlagerung des C-Terminus von NtNPR3 genauso wie bei AtNPR1 nicht möglich ist. Ein Vergleich weiterer bekannter biochemischer Eigenschaften legt somit eine größere funktionale Ähnlichkeit von AtNPR1 zu NtNPR3 als zu NtNPR1 nahe.
6.Die Analyse von mittels CRISPR/Cas9 erzeugten Mutanten in NtNPR1 und NtNPR3 zeigte, dass an den gewünschten Stellen im ersten Exon der Zielgene Deletionen und Insertionen eingebracht wurden, die zum Abbruch der Translation oder zur Veränderung des Leserahmens führten. Obwohl die Expression der PR1-Gene von NPR1 abhängt, konnte keine Reduktion der PR1-Akkumulation nach Induktion bei Pflanzen mit mutiertem NtNPR1-Gen beobachtet werden. Pflanzen mit NtNPR3 als Zielgen der Mutagenese zeigten dagegen in der F2-Generation unabhängiger Linien nach Induktion eine signifikante Reduktion der PR1-Akkumulation. Die Ergebnisse stehen im Einklang mit der biochemischen Analyse.
At und Nt NPR1 und weitere NPR-Familienmitglieder sind SA-sensitiv. Das Arginin im LENRV-ähnlichen Motiv vermittelt die Wahrnehmung von SA. Allerdings wirkt nur AtNPR1, nicht die Paralogen, als positiver Regulator der SAR. In Tabak ist NPR3 vermutlich das funktionale Homolog zu AtNPR1, obwohl NtNPR1 eine höhere Sequenzähnlichkeit zu AtNPR1 aufweist.
K1 Salicylsäure
K1 Abwehr
K1 NPR-Proteine
K1 LENRV-Motiv
K1  NPR1
PP Hohenheim
PB Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
UL http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2018/1545