RT Dissertation/Thesis T1 Neue Cytochrom P450 Enzyme des Sesquiterpenlacton Stoffwechsels der Sonnenblume (Helianthus annuus L.) A1 Frey,Maximilian WP 2017/03/06 AB In der vorliegenden Arbeit konnten der Aufklärung des Biosyntheseweges des Sesquiterpen-Metabolismus der Sonnenblume (Helianthus annuus) entscheidende Schritte hinzugefügt werden. Hierzu wurden zunächst aus einer Transkriptom Datenbank Kandidaten Sequenzen anhand von Expressions-Mustern und Ähnlichkeit zu bekannten, an STL-Stoffwechselwegen beteiligten P450-Enzymen gesucht. Mithilfe von 3´- und 5´-RACE-PCR wurden die offenen Leserahmen der Kandidaten aufgeklärt. Die anhand dieses Verfahrens ausgewählten, sowie weitere bereits beschriebene P450 Kandidaten Sequenzen wurden in Hefe-Vektoren transformiert und in Kombination mit verschiedenen Substrat-Vektoren exprimiert. Ein Hochdurchsatz Mikro-Ansatz wurde entwickelt, der die Expression und Analyse vieler Hefe Stämme im selben Zeitraum ermöglichte. Für die transiente Expression in N. benthamiana wurden die entsprechenden Gene bekannter und putativer Enzyme über Agrobakterien-Transformation in Tabak-Pflanzen eingebracht. Beim in planta Expressions-System wurde der komplette STL Stoffwechselweg der Sonnenblume bis zum Costunolid de novo in einem Schritt-für-Schritt Ansatz rekonstruiert. Die bereits bekannte Additionsreaktion von α-Methylen-γ-Lacton STL mit der Thiol-Gruppe von Cystein und Glutathion konnte bei allen untersuchten STL beobachtet werden. Als Referenz wurden STL-Addukte chemisch synthetisiert und mit den in planta erzeugten Produkten abgeglichen. Die Charakterisierung von Enzymen erfolgte somit in zwei unterschiedlichen in vivo Expressions-Systemen in Hefe (Saccharomyces cervisiae) und Tabak (Nicotiana benthamiana). Für den vorliegenden Stoffwechselweg wurden eine Reihe Unterschiede und Charakteristika der beiden Expressionssysteme herausgearbeitet. Kandidat M4 zeigte in Hefe ein unerwartetes Produkt (Farnesyl-δ-Lacton) und führte in Kombination mit HaG8H zur Produktion von Costunolid. Im pflanzlichen Expessions-System wurde Germacren A Säure von M4 auch in Abwesenheit von HaG8H zu Costunolid überführt. In beiden Fällen trug Kandidat M4 zur Synthese von Costunolid bei, und kann somit als Helianthus annuus Costunolid Synthase (HaCOS) bezeichnet werden, allerdings sollte der zu Grunde liegende Reaktionsmechanismus noch weiter aufgeklärt werden. Die Helianthus annuus Costunolid 14-Hydroxylase HaC14H (Kandidat M33) wurde in Hefe und Tabak charakterisiert, eine Einteilung in die Unterfamilie CYP71CB, zusammen mit TP8878, der Tanacetum parthenium Costunolid/Parthenoild 3β-Hydroxylase wird vorgeschlagen. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass in planta das Hauptprodukt der HaG8H höchstwahrscheinlich als Inunolid vorliegt, was den Biosyntheseweg hin zu 8-Epixanthatin und Tomentosin einleiten würde. Ein weiteres Enzym, Kandidat S2 aus der Arbeit von Ikezawa et al. (2011), konnte in planta, nicht aber in Hefe, 8β-Hydroxy-Germacren A Säure in 8β-Hydroxy-Costunolid/Eupatolid und mehrere Nebenprodukte umsetzen, dementsprechend wurde der Name Helianthus annuus Eupatolid Synthase, HaES vorgeschlagen. HaES besitzt 47 % Aminosäure Identität zur Parthenolid-Synthase von T. parthenium TpPTS, es wird eine Einteilung in eine eigene CYP71 Unterfamilie vorgeschlagen. Zwei alternative metabolische Routen führten bei der Expression in planta zur Bildung von 8β-Hydroxy-Costunolid, die zugrundeliegenden Mechanismen wurden diskutiert. Analysen der Expressionsmuster der am STL-Biosyntheseweg beteiligten Enzyme zeigen, dass die Gene auf den STL Synthesewegen auch in den inneren Geweben exprimiert sind und deren Expression in Blattprimordien parallel zur KDH Entwicklung und STL Produktion koordiniert hochreguliert wird. HaC14H lag in einer Region des Genoms in der Nähe einer Reihe weiterer P450 Enzymkandidaten, die sich in dieselbe Unterfamilie eingruppieren lassen und ebenfalls in den KDH exprimiert sind, weshalb eine Beteiligung von P450 Enzymen aus dieser Gruppe an weiteren Reaktionsschritten hin zu den komlpexeren STL der KDH plausibel wäre. K1 Sesquiterpenlactone K1 Enzym K1 Biosynthese K1 Nicotiana benthamiana K1 Sonnenblume PP Hohenheim PB Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim UL http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2017/1328