TY - THES T1 - Untersuchung einer Methode zur spezifischen Fluoreszenz – Markierung von Signalproteinen und deren Beobachtung in lebenden Escherichia coli (Einzelmolekültechnik & Perspektiven) A1 - Ehrhard,Tanja Margret Y1 - 2016/10/31 N2 - Störungen in der Signaltransduktion sind häufig die Ursache für Erkrankungen wie Krebs und Stoffwechselstörungen. Ein detailliertes Verständnis der relevanten Mecha-nismen der Signalübermittlung ist daher eine wichtige Voraussetzung für die Entwick-lung von Therapien und die Herstellung von Medikamenten. In dieser Arbeit wurde eine Methode entwickelt, die es erlaubt einzelne Signalproteine und deren Interaktionen in der lebenden Zelle zu beobachten, im Gegensatz zu molekularbiologischen Nachweis-verfahren, welche auf Ensemblemittelwerten beruhen. Als Modellsystem für die Signal-transduktion wurde die bakterielle Chemotaxis mit seinem Regulatorprotein CheY aus-gewählt. Die Untersuchungen wurden mit der Internen Totalreflektions-Fluoreszenzmikroskopie (TIRFM) durchgeführt, welche eine fluoreszente Markierung der zu untersuchenden Moleküle erfordert. Um eine spezifische und hintergrundredu-zierte Markierung zu gewährleisten, werden helle und photostabile fluoreszente ‚Tags‘ benötigt. In dieser Arbeit wurde das SNAP-tag System benutzt, das den Einsatz unter-schiedlicher Farbstoffe erlaubt. Ein Vorteil dieses Systems ist die Verwendung von fluoreszenzgelöschten Benzylguanin (BG)-Farbstoffen, die erst nach erfolgter Markie-rung eine starke Fluoreszenz zeigen. Für die Entwicklung der Markierungsmethode wurden zunächst in Vorexperimenten die Farbstoffe Atto 620, Atto 633, Atto 655 und Atto 680 eingehend auf ihre Fluorogenität, ihre Photostabilität und ihr Blinkverhalten hin analysiert. Die fundierte Kenntnis dieser Eigenschaften ist essentiell für die korrekte Interpretation der aus biologischen Experimenten gewonnen Ergebnissen. Ideal für das Verfahren sind Farbstoffe, die ein hohes Fluoreszenzsignal besitzen, über eine lange Beobachtungszeit stabil sind und nicht mit der Funktion des Zielmoleküls interferieren. Die Voruntersuchungen haben gezeigt, dass Atto 633 unter den getesteten Farbstoffen die besten photophysikalischen Eigenschaften für die Markierung mit dem SNAP-tag System besitzt und zudem die beste Zellgängigkeit aufweist. Es ist damit möglich, ein-zelne Moleküle unter kontinuierlicher Laseranregung über mehrere Sekunden zu be-obachten. Darüber hinaus konnte die Markierungseffizienz in gewissen Grenzen durch die Proteinexpression, die Farbstoffkonzentration und die Inkubationszeit des Farb-stoffs kontrolliert werden. Eine geringe Markierungseffizienz ist für die Einzelmolekül-Detektion von Vorteil, da eine zu hohe Dichte an fluoreszent markierten Molekülen die Identifikation einzelner Moleküle erschwert. Anschließend wurde ein Färbeprotokoll etabliert, welches eine spezifische, hinter-grundreduzierte Fluoreszenz-Markierung einzelner CheY-Proteine in lebenden E. coli-Zellen erlaubt, ohne dass die Funktionsfähigkeit des Proteins beeinträchtigt wird. Echt-zeit-Aufnahmen mit einer Zeitauflösung von 30 ms zeigten, dass es möglich ist, einzel-ne CheY-Moleküle bei der Bindung an einen Interaktionspartner als fluoreszenten Punkt zu beobachten. Aus den Fluoreszenzintensitätsspuren konnten die Bindungszu-stände mittels numerischer Verfahren als An- und Auszeiten extrahiert werden und deren Wahrscheinlichkeitsverteilung bestimmt werden. Aus diesen quantitativen Unter-suchungen zur Bindungskinetik von CheY konnten Hinweise auf spezifische Proteinin-teraktionen beobachtet, jedoch keine detaillierte Auskunft über Bindungszeiten gege-ben werden. Die Ursache hierfür könnten unterschiedliche Wechselwirkungen des Pro-teins, sowohl spezifischer als auch unspezifischer Art, sein. So wäre eine weitere wich-tige Entwicklung dieses Markierungssystems, die Möglichkeit zur gleichzeitigen Fär-bung von zwei oder mehreren Proteinen mit spektroskopisch unterscheidbaren fluores-zierenden ‚Tags‘ (z.B. dem CLIP-tag), um Kolokalisationsexperimente mit alternieren-der Laseranregung durchzuführen. Eine weitere Ursache kann man in der Natur des verwendeten Farbstoffes selbst suchen. Laser- und temperaturabhängige Untersu-chungen könnten weiteren Aufschluss über das Verhalten der Farbstoffe geben. Somit liefert das beschriebene Fluoreszenz-Markierungsverfahren einen neuen Ansatz für quantitative Untersuchungen von Proteininteraktionen in lebenden Zellen. KW - Chemotaxis KW - Fluoreszenz KW - Fluoreszenzmarkierung KW - SNAP-tag KW - TIRF-Mikroskopie CY - Hohenheim PB - Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim AD - Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart UR - http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2016/1275 ER -