TY  - THES
T1  - Untersuchung der lichtabhängigen Phosphorylierung des TRP-Kanals von Drosophila melanogaster
A1  - Bartels,Jonas-Peter
Y1  - 2016/06/09
N2  - Die Phototransduktionskaskade im Auge von Drosophila melanogaster mündet in der Öffnung der beiden Ionenkanäle TRP und TRPL. Der hierdurch hervorgerufene intrazelluläre Anstieg der Natrium- und Calciumionenkonzentration führt zur Ausbildung des Photorezeptorpotentials. Der TRP-Kanal unterliegt dabei einer lichtabhängigen Phosphorylierung, wobei 15 seiner Phosphorylierungsstellen eine verstärkte Phosphorylierung im Licht zeigen und eine Phosphorylierungsstelle eine verstärkte Phosphorylierung im Dunkeln aufweist. Zu Beginn dieser Arbeit waren weder die Funktion der lichtabhängigen TRP-Phosphorylierung, noch die an ihr beteiligten Kinasen und Phosphatasen bekannt.
In der vorliegenden Arbeit wurde deshalb nach Kinasen und Phosphatasen gesucht, die das Phosphorylierungsmuster des TRP-Kanals beeinflussen. Hierzu wurde ein Kandidaten-Screen mit 79 Kinase- und Phosphatasemutanten durchgeführt unter Verwendung von drei phosphospezifischen Antikörpern. In dem Screen wurden acht Kinasen und eine Phosphatase identifiziert, die die Phosphorylierung einer oder mehrerer der drei untersuchten Phosphorylierungsstellen beeinflussen. So zeigten die Mutanten der augenspezifischen Proteinkinase C (ePKC) und der Proteinkinase C 53E (PKC53E) eine verringerte Phosphorylierung an der Stelle T849 des TRP-Kanals, während die Mutanten der Kinase Rolled und der alpha-Untereinheit der AMP-abhängigen Kinase eine erhöhte Phosphorylierung an dieser Stelle zeigten. Die Mutanten der Caseinkinase Ialpha, Licorne, Tao und Metallophosphoesterase (MPPE) zeigten hingegen an der Phosphorylierungsstelle T864 eine verringerte Phosphorylierung. Die Nullmutante der Phosphatase Retinal Degeneration C (RDGC) zeigte eine drastisch verstärkte Phosphorylierung an der Phosphorylierungsstelle S936.
Von den identifizierten Kinase- und Phosphatasemutanten wiesen nur die Mutanten der Kinase ePKC und der Phosphatase RDGC bei ERG-Messungen Auffälligkeiten in Form einer bereits beschriebenen langsamen Deaktivierung der Lichtantwort auf. Zur Klärung der Frage, ob die veränderte Phosphorylierung des TRP-Kanals in den Mutanten der ePKC beziehungsweise der RDGC der Grund für die verlängerte Deaktivierung der Lichtantwort ist, wurden transgene Fliegen hergestellt, die modifizierte TRP-Kanäle exprimieren. Hierzu wurden die ePKC-abhängige Phosphorylierungsstelle T849 oder die RDGC-abhängige Phosphorylierungsstelle S936 des TRP-Kanals durch die Aminosäure Alanin oder Asparaginsäure ersetzt. Die biochemische Analyse dieser vier transgenen Fliegen offenbarte wildtypische Eigenschaften der modifizierten Kanäle in Bezug auf die subzelluläre Lokalisation, die Interaktion mit dem Gerüstprotein INAD, die Multimerisierung und die Expressionsrate. Elektrophysiologische Untersuchungen dieser transgenen Fliegen zeigten hingegen eine Verlängerung der Deaktivierungszeit im ERG sowohl durch den Austausch von T849 zu Alanin als auch durch den Austausch von S936 zu Asparaginsäure. Während der Austausch von Serin oder Threonin zu Alanin eine Phosphorylierung verhindert, wirkt der Austausch zu Asparaginsäure in der Regel phosphomimetisch. In der Wildtypsituation liegt T849 im Licht phosphoryliert und im Dunkeln dephosphoryliert vor, während bei S936 genau das Gegenteil der Fall ist. Die Aminosäureaustausche an den beiden Phosphorylierungsstellen ahmen also den Phosphorylierungszustand in dunkeladaptierten Wildtyp-Fliegen nach.
Zusammenfassend demonstrieren die Ergebnisse die Beteiligung von acht Kinasen und einer Phosphatase an der Einstellung des Phosphorylierungszustands des TRP-Kanals. Zwei der Phosphorylierungsstellen des TRP-Kanals vermitteln die schnelle Deaktivierung der Lichtantwort.
KW  - Drosophila
KW  - Kanal
KW  - Auge
CY  - Hohenheim
PB  - Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
AD  - Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart
UR  - http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2016/1215
ER  -