RT Dissertation/Thesis
T1 Charakterisierung von Interaktionspartnern des Kernrezeptors CAR (?Constitutive Androstane Receptor?) mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie
A1 Melgar,Clint
WP 2011/03/03
AB Der konstititutive Androstanrezeptor (constitutive androstane receptor; CAR; NR1I3), ein Kernrezeptor, spielt eine entscheidende Rolle in der Induktion des Arzneimittelmetabolismus und -transports durch Aktivatoren vom Phenobarbital-Typ. Die hepatische Expression zahlreicher arzneimittelmetabolisiernder Enzyme der Phase I und Phase II sowie von Transportproteinen wird durch CAR als Antwort auf diverse Chemikalien induziert. Neben seiner Funktion in der Entgiftung von Fremdstoffen ist CAR auch involviert in andere hepatische Funktionen wie Fettsäureoxidation, Glukoneogenese und die Sekretion von Steroidhormonen und Bilirubin. In primären Hepatozyten ist CAR vorwiegend im Cytoplasma lokalisiert und mit anderen Proteinen in einem großen Multimerkomplex assoziiert, dessen Komponenten noch nicht vollständig identifiziert wurden. Durch Aktivatoren wie Phenobarbital dissoziiert CAR von bekannten Proteinen des Multimerkomplexes, dem cytosolischen CAR-Retentionsprotein (CCRP) und dem Chaperon HSP90. Dies führt nach Dephosphorylierung durch die Proteinphosphatase 2A (PP2A) zur Translokation in den Nukleus, wo CAR mit dem Retinoid-X-Rezeptor (RXR) heterodimerisiert. CAR-RXR bindet an die entsprechenden DNA-Bindungsstellen in der regulatorischen Region der Zielgene und rekrutiert Ko-Aktivatoren wie  SRC-1 (Steroidrezeptor Ko-Aktivator), GRIP1 (Glutamatrezeptor interagierendes Protein) und PGC-1 (Peroxisom-Proliferator-aktivierten Rezeptor γ Ko-Aktivator 1), um die Gentranskription zu induzieren. 
Ziel dieser Arbeit war es, den in der Leber exprimierten Kernrezeptor CAR auf putative Interaktionspartner zu untersuchen, um eventuell Hinweise auf Aufbau und Regulation des nativen Proteinmultimerkomplexes zu erhalten und um die Funktion von CAR besser verstehen zu können.
Zu diesem Zweck wurde ein in vitro Pulldown-Assay mit Leberhomogenat zur Analyse von Protein-Protein-Interaktionen von CAR etabliert. Als ersten Schritt wurden GST und GST-CAR-LBD-Fusionsproteine generiert, die in E. coli Bakterienzellen exprimiert und anschließend affinitätsgereinigt wurden. Die Fusionsproteine wurden mit Leberhomogenat inkubiert und gebundene Proteine mittels SDS-PAGE aufgetrennt. Nach Visualisierung mit Silbernitrat wurden die Proteinbanden ausgeschnitten und für die Massenspektrometrie präpariert. Neue Interaktionspartner von CAR wurden über die massenspektrometrische MALDI (Matrix assisted Laser Desorption/Ionisation)-Methode identifiziert. 
Nach Optimierung der Pulldown-Methode wurden diverse Strukturproteine, Transportproteine und Enzyme signifikant als putative neue Interaktionspartner von CAR identifiziert, u.a. das Hitzeschockprotein 70, die Pyruvatcarboxylase, GAPDH, Carbonylreduktase, Lamin A, Phosphatidylinositol Transferprotein 1 und BAF 155 (BRG1-assoziierter Faktor). 
Als besonders interessanter potenzieller Interaktionspartner von CAR wurde das Protein BAF 155 im Rahmen dieser Arbeit näher untersucht. Dieses Protein ist Bestandteil eines Säuger-SWI / SNF Chromatin-?remodeling? Komplexes, der in fundamentalen zellulären Prozessen wie Transkription, Replikation und Reparatur von Chromatin eine wichtige Rolle spielt. Die Interaktion des GST-CAR Fusionsproteins mit BAF 155 wurde mit verschiedenen Methoden wie in vitro GST-Pulldown-Assay und in vivo Immunpräzipitation bestätigt. Im Western Blot wurde BAF 155 in den Pulldown-Proben mit Leberhomogenat ebenfalls nachgewiesen. Eine funktionelle Analyse der Interaktion mittels RNA-Interferenz war leider nicht erfolgreich, da die Methode aus Zeitgründen nicht mehr erfolgreich optimiert und validiert werden konnte. Zusammenfassend konnte der Pulldown-Assay, kombiniert mit massenspektrometrischen MALDI-TOF Analysen, als eine reproduzierbare Methode zur Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen etabliert werden und lieferte diverse neue putative Interaktionspartner von CAR. Das in dieser Arbeit identifizierte Protein BAF 155 bzw. der ganze SWI / SNF Komplex könnten eine wichtige Rolle in der CAR-induzierten transkriptionalen Aktivierung spielen. 
K1  konstitutiver Androstanrezeptor
K1 Kernrezeptor, MALDI-MS 
PP Hohenheim
PB Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
UL http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2011/573